2020, Vol. 12 
多溴联苯醚(Polybrominated diphenyl ethers，PBDEs)是一类溴化阻燃化学品，因其价格低廉和具有良好的阻燃作用，已被广泛应用于纺织、电子、塑料和家具等以聚合物为基础的消费品生产中[1]。由于PBDEs不以化学键与聚合物结合，因此容易从添加到的聚合物中析出从而释放进入环境。目前，PBDEs在大部分的环境介质(例如沉积物、大气、地表水和海洋环境)中被广泛检出[2-3]。在209种PBDEs中，2, 2’, 4, 4’-四溴联苯醚(BDE-47)是在人类血液和牛奶中检出浓度最高的一种同系物，约占人体PBDEs总暴露量的50% [4]。
随着BDE-47大规模的生产和使用，导致其大量释放进入环境中，对生态环境和人类健康造成了严重威胁。由于PBDEs水溶性较低，水体中大部分PBDEs以悬浮颗粒物结合形式存在。已有的研究表明，自然水体中PBDEs含量一般不高，多为未检出到几百pg / L [5-7]，污水处理厂出水中的质量浓度较高。Wang等[8]对巢湖7条入湖河流中PBDEs的污染情况进行了调查，发现∑8PBDEs的质量浓度范围为0.31~84 ng/L，其中BDE-47、五溴联苯醚(BDE-99)和2, 2′, 4, 4′, 5, 5′-六溴联苯醚(BDE-153)的质量浓度分别为0.012~0.36、0.012~1.3和0.012~0.77 ng/L。四川锦江河BDE-47在水体、底泥、鱼肉、鱼鳃、内脏的平均值分别为0.25 ng/L、0.29 ng/g (干重)、15.7 ng/g(脂肪)、9.32 ng/g(脂肪)、15.8 ng/g(脂肪)[9]。
PBDEs可以通过食物的摄取、呼吸等途径进入人体。研究发现，华南地区孕妇胎盘、母乳、胎儿脐血和新生儿尿液中的∑17PBDEs质量比分别为(15.8±9.88) ng/g(脂肪)、(13.2±7.64) ng/g(脂肪)、(16.5±19.5) ng/g(脂肪)和(0.001 80±0.001 99) ng/L，BDE-47是所有样本中最主要的同系物种类，约占∑17PBDE的24.7%~56.8%[10]。值得注意的是，电子垃圾回收站和阻燃剂生产区居民血清中PBDEs水平较高。研究表明，电子废弃物回收工人和电子废弃物拆解工人血清中∑PBDEs的质量比分别为105~4 099 ng/g(脂肪)(BDE-28、-47、-66、-99、-100、-153、-154、-183、-209)和5.58~228.52 ng/g(脂肪)(BDE-196、-197、-203、-206、-207、-208、-209)[11]。
BDE-47具有内分泌干扰毒性、神经毒性、肝脏毒性、生殖毒性及免疫毒性等[12-15]。目前的研究热点主要集中于BDE-47的发育毒性、生殖毒性和神经毒性方面。动物实验研究表明，雌性小鼠在孕期暴露BDE-47可造成子代发育迟缓，行为改变[16-17]。BDE-47及其衍生物暴露能够诱导啮齿类发育神经毒性，引起大脑结构和功能的改变，最终导致行为异常[18]。然而，目前关于BDE-47的神经毒性研究仍处于起步阶段，相关的研究多集中于认知功能、行为改变、学习与记忆等毒性表征方面。研究发现，斑马鱼成鱼连续暴露于0.5 mg/L的BDE-47，可导致斑马鱼空间学习和记忆能力下降，并与暴露天数的增加有时间效应关系[19]。同时，Zhang等[20]研究发现，0.5 mg/L的BDE-47引起斑马鱼幼鱼社交行为改变，社会活动接触数和每次接触时间显著增加。然而，目前关于BDE-47的神经毒性作用机制尚缺乏系统研究。吉贵祥等[21]研究发现，BDE-47可以影响斑马鱼体内抗氧化防御系统，并能诱导细胞凋亡。Wang等[14]研究发现，BDE-47通过产生氧化应激导致细胞凋亡从而对斑马鱼造成神经毒性作用，而异甘草素(isiquiritigenin，ISL)和乙酰半胱氨酸(N-Acetyl-cysteine，NAC)作为典型抗氧化剂可以缓解BDE-47的神经毒性作用。然而，关于BDE-47是否可能通过干扰神经发育从而诱导行为缺陷还有待证实。
近年来，转基因斑马鱼作为脊椎动物模型在神经发育毒性研究中得到越来越广泛的应用[22-23]。与啮齿动物模型相比，斑马鱼在研究神经发育毒性方面的优势包括：(1)胚胎在母体体外发育，消除了母体毒性作为混杂因素的影响；(2)斑马鱼在早期发育阶段是透明的，可使用显微技术直接拍摄神经细胞的发育情况；(3)斑马鱼体积小，胚胎发育快，生命周期短。elavl3基因别名huc，最早在果蝇中发现，该基因缺失会导致视觉神经系统缺陷伴随神经系统发育不良，严重致死。elavl3在斑马鱼早期神经发育过程中发挥了重要的作用，是神经系统发育的重要标记基因[24-25]。利用基因修饰技术，在elavl3的启动子区接入绿色荧光蛋白(EGFP)表达基因，培育的Tg(elavl3:EGFP)转基因斑马鱼可以在全身神经元中特异表现出绿色荧光，利用荧光显微镜可以直观地观察化学物质对神经系统发育的影响。
现通过BDE-47不同处理组斑马鱼幼鱼行为轨迹来快速筛选BDE-47是否具有神经毒性。同时，使用转基因斑马鱼胚胎Tg(elavl3:EGFP)作为模式生物，通过测定神经细胞的荧光强度来量化BDE-47暴露后中枢神经细胞的表达量，从而观察斑马鱼中枢神经的发育情况。最后进行荧光定量聚合酶链式反应(PCR)实验，探究神经发育相关的基因是否发生改变，进一步评估BDE-47对斑马鱼的神经发育毒性。
1 材料与方法 1.1 仪器与试剂仪器：MS105DU电子分析天平(德国METTLER TOLEDO公司)；HQ40d水质参数仪(美国哈希公司)；MGC-400B恒温光照培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)；ABI-7300荧光定量PCR仪(美国应用生物系统公司)；斑马鱼行为轨迹分析仪(荷兰Noldus公司)；LSM510激光共聚焦显微镜(德国ZEISS公司)。
试剂：BDE-47购自美国Chemservice公司；二甲基亚砜(DMSO)购自Sigma公司；反转录试剂盒购自美国QiaGen公司；TRIzol©试剂购自美国赛默飞世尔公司；三氯甲烷和异丙醇购自国药集团化学试剂有限公司。
1.2 种鱼饲养和胚胎收集研究使用的斑马鱼品系为AB野生型和Tg(elavl3:EGFP)，种鱼均购自中国科学院水生生物研究所(武汉)。在流水式循环饲养系统(ESEN-AW-SS-G-A，北京爱生)饲养种鱼，水温控制在(27±0.5)℃，光照周期为14 h光照/10 h暗光。种鱼每天投喂刚孵化的丰年虫2次，并及时清除多余的饲料和排泄物。在繁殖的前一天，雄鱼和雌鱼以1:1的比例放入繁殖盒中，用隔板将繁殖盒中的亲鱼雌雄分开。次日清晨，将繁殖盒中的隔板拆掉，在光照的刺激下，雄鱼开始追逐雌鱼，雌鱼开始产卵，收集所产受精卵。在显微镜下挑选正常发育的受精卵用磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline, PBS)冲洗3次，用于暴露实验。
1.3 胚胎和幼鱼毒性试验参考Chen等[26]和Wang等[14]的研究，选择1，5和10 μmol/L不同浓度的BDE-47暴露组进行暴露。BDE-47使用DMSO配制成母液，-20℃保存，溶液配制采用贮备液逐级梯度稀释，使溶液中DMSO含量＜1/10 000。胚胎收取后培养至受精后4 h(4 hours post fertilization，4 hpf)，挑选发育正常的斑马鱼胚胎进行不同处理组暴露，随机分组分别暴露于0(对照)，1，5和10 μmol/L的BDE-47处理液中。每个剂量组中放置鱼卵50粒，每个剂量组设置3个平行，间隔12 h更换胚胎处理液以保证暴露组浓度，期间观察斑马鱼胚胎发育生长的过程，挑出死亡的胚胎。
1.4 斑马鱼运动行为测试根据Nery等[27]的实验方法，每个浓度组随机选择24条受精后6 d(6 days post fertilization，6 dpf)的斑马鱼幼鱼放入24孔板，选择健康能够正常游动的斑马鱼幼鱼，在24孔板中加入2 mL的曝气水，每个孔中1条斑马鱼幼鱼，随后轻柔安置于斑马鱼行为分析仪中进行运动行为学测试，主要测试幼鱼的自由游泳行为和在光周期下的游泳行为。受试鱼在实验之前进行10 min的环境适应，实验后剔除不正常幼鱼的行为数据(不正常的数据主要有仪器检测出现极值，相应删除数据或者进行多次重复实验)。使用EthoVision软件(荷兰Noldus公司)分别采集40 min内各组幼鱼的运动轨迹，利用软件导出运动行为距离、游行时间和游动的行为轨迹，然后计算每组鱼游行的平均速度和平均距离，各数值分别纳入统计。
1.5 转基因斑马鱼图像观察Tg(elavl3:EGFP)斑马鱼胚胎暴露于0，1，5和10 μmol/L BDE-47水溶液中，每个浓度组选择10条斑马鱼幼鱼(72 hpf)，采用4%的多聚甲醛固定30 min，采用体视荧光显微镜(SMZ18，日本尼康)拍摄绿色荧光标记的神经细胞并记录图像，使用Image J软件定量分析斑马鱼中枢神经发育的变化。
1.6 荧光定量PCR采用荧光定量PCR测定方法，利用Primer Premier软件设计并合成神经发育关键基因包括elav13基因和mbp基因以及内参照基因(β-actin)的Real-time PCR引物，基因的引物序列见表 1。每个浓度组收集6 dpf期的幼鱼各20条，提取幼鱼总RNA，逆转录得到cDNA，进行Real-time PCR实验，检测BDE-47暴露对斑马鱼神经发育关键基因转录的影响。
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表 1 基因引物序列 |
所有实验至少重复3次。采用单因素方差分析或配对t检验，所有统计分析，使用SAS统计分析系统(version 9.13, SAS Institute, Cary, NC)进行，设P＜0.05时有统计学差异。
2 结果与分析 2.1 BDE-47对斑马鱼幼鱼运动行为的影响对暴露于BDE-47(0, 1, 5和10 μmol/L)6 dpf的斑马鱼幼鱼进行行为学测试，在连续暴露BDE-47 6 d之后，空白对照组孵化率＞80%，孵化后存活率＞90%，本次实验有效。行为分析学研究如图 1(a)(b)所示，除1 μmol/L低剂量处理组，其余处理组6 dpf斑马鱼幼鱼运动行为速度显著下降，具有统计学差异(P＜0.05)。图 1(b)显示，随着BDE-47浓度的增加，斑马鱼幼鱼游动轨迹呈剂量依赖性降低。
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图 1 BDE-47暴露对斑马鱼幼鱼(6 dpf)运动行为的影响 |
Tg(elavl3:EGFP)斑马鱼幼鱼暴露于BDE-47(0, 1, 5和10 μmol/L)至72 dpf(72 dpf后斑马鱼幼鱼荧光逐渐减弱)，中枢神经荧光如图 2(a)(b)(c)(d)所示，Tg(elavl3:EGFP)斑马鱼幼鱼头部绿色荧光标记的神经细胞荧光强度随BDE-47的浓度增加而呈剂量依赖性降低。荧光定量分析结果如图 3所示，5和10 μmol/L BDE-47处理组显著抑制斑马鱼幼鱼的神经细胞发育，具有统计学差异(P＜0.05)。
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图 2 不同暴露组转基因斑马鱼幼鱼中枢神经荧光图 |
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图 3 BDE-47暴露对6 dpf转基因斑马鱼幼鱼中枢神经荧光定量 |
对6 dpf的斑马鱼幼鱼体内神经发育相关基因(elavl3和mbp)的表达情况进行检测，结果见图 4(a)(b)，中高剂量组(5和10 μmol/L)与对照组
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图 4 BDE-47暴露对斑马鱼幼鱼(6 dpf)神经发育相关基因的影响 |
相比，elavl3基因水平明显下调；mbp基因在10 μmol/L暴露浓度下，基因表达量明显下调，说明BDE-47暴露抑制斑马鱼幼鱼的早期神经发育相关基因的表达。
3 讨论目前，体外和体内试验已经广泛证实了BDE-47的发育神经毒性。例如，Liu等[28]利用大型蚤和大型金线虫为模型，发现BDE-47、6-羟基-2，2’，4，4’-四溴二苯醚(6-OH-BDE-47)和6-甲氧基-2，2’，4，4’-四溴联苯醚(6-MeO-BDE-47)干扰内分泌和氧化应激系统，产生的神经毒性。此外，Costa等[29]研究发现BDE-47可诱导体外培养的小鼠小脑颗粒神经元氧化应激，继而导致细胞凋亡产生神经毒性。
本研究发现，BDE-47暴露能够显著抑制斑马鱼幼鱼的运动行为，这与之前的研究相一致[14]。为在基因水平探讨BDE-47的神经发育毒性作用机制，探究了斑马鱼神经发育关键基因的表达情况。Elavl3基因编码神经特异性RNA结合蛋白Huc，被认为是早期神经元的生物标记物[30]。在髓鞘少突胶质细胞中发现的mbp基因也被认为是神经发育的生物标记物[31]。本研究发现，BDE-47暴露显著抑制神经发育相关基因elavl3和mbp，产生的神经毒性表现为斑马鱼幼鱼运动行为抑制。转基因斑马鱼Tg(elavl3:EGFP)使用神经发育标记基因elavl3的启动子绿色荧光表达，两者结果一致。
综上所述，BDE-47暴露能够显著抑制斑马鱼幼鱼的运动行为，这可能与神经发育关键基因的表达抑制有关。BDE-47暴露后，在转基因斑马鱼Tg(elavl3:EGFP)直观地观察到了中枢神经细胞发育受到显著抑制，并且呈剂量依赖效应，结合神经发育关键基因表达量的抑制，进一步证实了BDE-47产生神经毒性可能与中枢神经发育被抑制有关。本研究关于BDE-47的神经毒性机制研究还不够深入，其确切毒性作用机制及其环境污染状况、人群暴露和毒性作用亟待开展更为深入的研究。
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