大环内酯及林可酰胺类抗生素作为重要的抑菌、抗菌和消炎药物，被广泛应用于医疗卫生、养殖业、畜牧业和农业等领域^[1-2]。这些物质经动物或者人体摄入后，以原形或代谢产物的形式进入江河流域，对人类与环境造成严重危害。近年来，相继出现从地表水、地下水、污泥和饮用水中检出大环内酯及林可酰胺类抗生素的报道^[3-4]。对此，为了更好地掌握大环内酯及林可酰胺类抗生素在环境中的检出情况，摸清其污染规律，Gao等^[5]对北京市8个污水处理厂开展调查研究，结果表明，污水处理厂作为抗生素的主要排放途径，对大环内酯类抗生素的去除率仅为17%~56%，对某些抗生素甚至完全无法去除。重庆市于2017年组织开展了水质抗生素的生产、使用和环境污染状况调查及综合评价工作，选取畜牧和水产养殖这2个主要抗生素使用行业，对全市使用范围较广、使用量较大的磺胺类、喹诺酮类、四环素类、大环内酯及林可酰胺5大类54种抗生素的污染现状进行了全面监测评估。结果显示，这几类抗生素均有不同程度的检出，其中大环内酯及林可酰胺类抗生素的检出比例相加高达17.3%。

大环内酯及林可酰胺类抗生素结构复杂、种类繁多，进入水体后，不仅会严重影响环境中的微生物种群特性及群落分布，导致生态失衡，而且会诱导生成耐药细菌株，产生抗性基因，对人类和环境造成巨大的威胁^[6-7]。因此，研究建立水环境中大环内酯及林可酰胺类抗生素残留量的快速、灵敏、准确的分析方法和质量控制体系是亟待解决的问题。目前，大环内酯及林可酰胺类抗生素标准检测方法主要有微生物检测法、气相色谱法、气相色谱-质谱法以及高效液相色谱-串联质谱法等^[8-9]。微生物检测法利用对抗菌药物敏感的菌株作为指示生物体，将提取液和标准溶液对照，再根据最低抑菌浓度推算出提取液中的药物浓度，但是该方法手续烦琐、不易操作^[10]。气相色谱法、气相色谱-质谱法由于其主要用于检测具有易挥发和热稳定性质的化合物，已较少使用^[11]。高效液相色谱-串联质谱法兼具液相色谱与质谱两者的优点，分析范围更广、分离效率更高、实用性更强，适用于对水环境中抗生素类多组分物质的快速检测^[12]。

现讨论了流动相和溶液pH值等因素对不同浓度抗生素水样中目标物分离的影响，开展了抗生素标准样品的保存方法、保存时间等的研究，建立了一套准确、灵敏、高效、完整的标准方法体系，涵盖从样品采集、样品保存、分析检测到质量控制和质量保证等全过程。

1 实验部分 1.1 样品采集

参照《地表水和污水监测技术规范》(HJ/T 91—2019)的相关规定采集养殖废水样品，水样采集于1 000 mL的磨口棕色玻璃瓶中，充满样品瓶，不留液上空间。

1.2 仪器与试剂 1.2.1 仪器

TSQ Quantum超高效液相色谱-三重四极杆质谱仪(美国Themo Fisher公司)，配置电喷雾离子源(ESI)；Oasis HLB固相萃取柱(6 mL/150 mg，赛默飞世尔科技有限公司)；HYPERSIL GOLD C18色谱柱(100 mm×2.1 mm×1.9 μm，赛默飞世尔科技有限公司)；0.20 μm聚丙烯(GHP)针式微孔滤膜、0.22 μm聚醚砜滤膜和0.22 μm尼龙66微孔滤膜(北京颇尔过滤器有限公司)。

1.2.2 试剂

标准物质：大环内酯类(麦迪霉素、克拉霉素、罗红霉素、琥乙红霉素、螺旋霉素、竹桃三乙酸、交沙霉素)，林可酰胺类(林可霉素、克林霉素)，内标物(红霉素-C₁₃D₃)，均购自德国Dr Ehrenstorfer公司。其他试剂：甲醇和甲酸(色谱纯，上海阿拉丁化学试剂有限公司); 乙二胺四乙酸二钠(Na₂EDTA)和氨水(分析纯，上海阿拉丁化学试剂有限公司)。

1.3 仪器分析条件 1.3.1 色谱条件

进样量：10 μL；流动相：流动相A为0.05%的甲酸溶液(V/V)，流动相B为甲醇；流速：200 μL/min。梯度洗脱程序见表 1。

1.3.2 质谱条件

选择电喷雾电离源(ESI源)，分别选择在正离子和负离子模式下扫描，对比分析发现9种目标化合物在正离子模式下有更好的响应，因此实验选定[M⁺H]⁺为母离子进行二级质谱扫描，寻找子离子碎片，选择响应较高的2~3个子离子分别作为定性子离子和定量子离子，并优化其相应的碰撞能量，以多反应监测模式(MRM)分析，建立质谱分析方法。具体质谱条件见表 2。

1.4 样品前处理

采用0.45 μm滤膜滤掉不溶性固体等杂质，移取适量滤液，加入1 g/L的Na₂EDTA，调节水样pH值为4~6，依次加入10 mL甲醇、10 mL去离子水活化固相萃取柱，控制水样以低于10 mL/min(约3~4滴/s)的流速缓慢通过固相萃取柱，用10 mL蒸馏水、10 mL甲醇反洗萃取柱，氮吹近干，加入5 μL 10 mg/L的内标使用溶液，用初始流动相定容至1 mL后上机分析。

2 结果与讨论 2.1 样品保存时间对测定结果的影响

吸取1.00 mg/L大环内酯及林可酰胺类标准使用液20 μL，用水定容至1.00 mL，分别置于棕色玻璃小瓶中，考察其在4 ℃冷藏条件下，存放1，2，4，7和14 d后的变化。实验发现，罗红霉素、琥乙红霉素、螺旋霉素在放置14 d后质量浓度略有下降(图 1)，其余6种物质放置14 d后，质量浓度均无显著变化。因此，应采用避光冷藏保存，且保存时间不超过14 d。

2.2 样品pH值对测定结果的影响

考察pH值为4，6，8和10的加标样品的加标回收率，样品pH值对测定结果的影响见图 2。由图 2可见，碱性条件时(pH值为8，10)，除交沙霉素外，其余物质的加标回收率明显低于酸性条件时；pH值为6时，加标回收率普遍较优，因此选择pH值为6。

2.3 仪器上样速率对测定结果的影响

考察上样速度分别为2，5，10 mL/min对空白加标回收率的影响，见图 3。由图 3可见，3种流速对测定结果影响不大，但流速为5 mL/min时9种目标化合物平均加标回收率最优，因此选取上样速度为5 mL/min。

2.4 洗脱液对测定结果的影响

实验考察了10 mL甲醇、10 mL 2%甲酸-甲醇和10 mL 1%氨水-甲醇溶液这3种洗脱液对加标回收率的影响，见图 4。由图 4可见，10 mL甲醇作为洗脱液时对目标化合物的加标回收率影响不大，10 mL 2%甲酸-甲醇或10mL 1%氨水-甲醇作为洗脱液时加标回收率均有显著下降，因此选择10 mL甲醇作为洗脱液。

2.5 滤膜材质对测定结果的影响

由于水样中目标物结构的差异，导致其亲水性、溶解度以及赋存浓度等具有较大差别，因此不同过滤材质对目标物的吸附能力也存在差异^[13-14]。分别研究0.22 μm尼龙、0.20 μm GHP和0.22 μm聚醚砜滤膜对空白加标量为5，20 μg/L和地表水加标量为5 μg/L的3种样品进行加标回收实验，测定结果见图 5(a)(b)。由图 5可见，尼龙滤膜的加标回收率最差，聚醚砜滤膜次之，GHP滤膜最佳，且GHP滤膜的相对标准偏差(RSD)最小，与文献报道一致^[14-15]。因此选择0.20 μm GHP的针式过滤器进行过滤。

2.6 标准曲线、检出限和测定下限

依次配制质量浓度为1.00，2.00，5.00，10.0，20.0，50.0和100.0 μg/L的目标化合物标准溶液，分别加入5.0 μL 10 mg/L的内标溶液，贮存在棕色进样小瓶中进行分析。以定量离子对的峰面积与内标峰面积之比(y)和对应的质量浓度(x)进行线性回归，得到线性回归方程。按照《环境监测分析方法标准制订技术导则》(HJ 168—2020)的要求，分别配置7份1 000 mL 5.00 ng/L的平行样，经全过程分析，计算方法检出限，以4倍方法检出限确定为测定下限，各目标物的检出限范围为0.78~1.22 ng/L，测定下限低于文献^[14]的报道，结果见表 3。

2.7 加标回收实验

配置质量浓度为10 ng/L的空白加标样品，进行全过程分析，各目标化合物的加标回收率为71.4%~126%，RSD为2.4%~7.1%(表 4)，说明此方法具有较好的准确性，能够用于大环内酯及林可酰胺类水质样品的测定。

2.8 日内、日间重复实验

配置质量浓度为10 ng/L的空白加标样品12份，分别置于棕色玻璃小瓶中，采用全过程分析法，4℃冷藏，测定存放2 h和1，2，4，7 d后目标物质的加标回收率，以考察实验的日内、日间重复性，结果见表 5。由表 5可见，各目标化合物在存放2 h和1，2，4，7 d测定，RSD分别为2.7%~7.8%，2.3%~8.6%，2.7%~8.7%，2.9%~9.7%和3.7%~9.4%，7 d内RSD平均值为4.3%~7.2%。说明此方法进行水质中大环内酯及林可酰胺类抗生素的测定具有较好的重复性。

2.9 实际样品分析

选取嘉临江支流卫星水库出口坝断面和某养殖企业(大环内酯及林可酰胺类抗生素用量较大)污水处理站出口水样，进行全过程分析，实验结果见表 6。由表 6可见，卫星水库出口坝断面地表水中有螺旋霉素和竹桃三乙酸检出，而养殖企业的污水出口水样中有螺旋霉素、克拉霉素、林可霉素、竹桃三乙酸和罗红霉素5种化合物检出，说明该方法能对实际样品进行较好的监测和应用。

3 结论

建立了采用固相萃取-超高效液相色谱三重四极杆质谱联用法同时测定水中9种大环内酯及林可酰胺类抗生素的方法，9种目标化合物的检出限为0.78~1.22 ng/L，测定下限为3.10~4.87 ng/L，加标回收率为71.4%~126%。该方法灵敏度高，检出限低，在环境水体中的大环内酯及林可酰胺类抗生素监测方面有较广阔的应用前景，可为后续建立生态环境领域抗生素分析方法标准及污染排放标准提供技术支撑。