2022, Vol. 14 
三氯生(TCS)和三氯卡班(TCC)是高效广谱抗菌剂，因其皮肤相容性好和脂溶性较强，被广泛应用于护肤品、纺织品和消毒剂等产品[1-2]。但TCS和TCC均具有较强的生物毒性，是一种新型内分泌干扰物，可通过食物链在生物体富集，危害人体健康和生态系统。对TCS和TCC的毒性研究表明，小鼠急性经口的半数致死量(LD50值)为1 470 mg/kg，属于低毒[3]，但长期暴露于大剂量TCS中，会引发免疫系统紊乱及肝肾受损[4]，TCC可通过影响细胞周期进程等破坏小鼠卵母细胞的成熟，产生生殖毒性[5]。目前环境中TCS和TCC的重要来源是污水处理厂的污水和底泥，传统活性污泥法能去除污水中90%的TCS和TCC，但仅有30%~40%可被生物降解[6]。因TCS和TCC的疏水性和污泥的强吸附性，其大部分被吸附储存在污泥中，有研究表明，污泥中TCS的质量分数为0.028~37.189 mg/kg[7-8]，TCC为2.17~5.97 mg/kg[9]。因此，建立一种准确、快速、低成本的检测方法具有重要意义。
污泥堆肥样品中的TCS和TCC的检测难点在于样品基质复杂，且对疏水性有机物有强吸附作用。基于此，通常污泥堆肥样品的前处理步骤分为萃取和净化。目前，应用到污泥堆肥样品的萃取方法有索氏提取法[10-12]、加速溶剂萃取法(ASE)[13-15]和超声提取法等[16-17]，净化技术一般有柱层析法、凝胶渗透色谱法[11, 18]和固相萃取法等[19]。与索氏提取法等传统萃取技术相比，加速溶剂萃取法耗时少、溶剂消耗少、提取效率高，已被广泛应用，但后续净化步骤仍然耗时费力。通过在萃取池内填入吸附材料实现一步提取净化的方法更高效、快速且误差更小[20]，这种方法已被用来检测不同基质样品中的持久性有毒污染物，如复杂基质中的农药[21]，土壤[22]、沉积物[23]和污泥样品[24]中的多环芳烃，土壤[25]、大气颗粒物[26]、饲料[27]及海洋样品[28]中的多溴二苯醚(PBDEs)等，但对污泥堆肥样品中的TCS和TCC的检测方法还不完善。
建立了加速溶剂萃取-在线净化-液相色谱串联质谱法检测污泥堆肥样品中的TCS和TCC的分析方法，对萃取溶剂、温度、静态时间、循环次数以及净化吸附材料的类型和用量进行优化，为污泥堆肥样品中TCS和TCC的风险评估和污染管理提供技术支撑。
1 实验部分 1.1 仪器与试剂仪器：LCMS 8045高效液相色谱-三重四极杆质谱仪(日本岛津公司)；Shim-pack GIST-HP C18色谱柱(3.0 μm×2.1 mm×50 mm，日本岛津公司)；ASE 350加速溶剂萃取仪(美国Thermo Fisher公司)；R-215旋转蒸发仪(瑞士BUCHI公司)；N-EVAP-112氮吹仪(美国Organomation公司)；玻璃纤维膜(30 mm，美国Thermo Fisher公司)；有机滤膜(0.22 μm，上海安谱公司)。
试剂：TCS和TCC标准样品(1 g /L，美国AccuStandard公司)；正己烷、二氯甲烷、甲醇、丙酮(HPLC级，德国Duksan Pure Chemicals公司)；100~300目中性氧化铝、100~200目弗罗里硅土、40~43目酸性硅胶、N-丙基乙二胺(PSA)(德国CNW试剂公司)；铜粉、无水硫酸钠(优级纯，上海安谱公司)；10~20目硅藻土(美国Thermo Fisher公司)。
1.2 样品采集与储存采集：样品取自上海松江污水处理厂，含水率为80%~90%。
储存：于-20 ℃下转移至实验室，使用冷冻干燥机低温冷冻干燥，研磨过60目筛后于4 ℃黑暗条件储存。
1.3 样品前处理加速溶剂萃取-在线净化法是通过在萃取池中填入特定的填料和样品，同时完成样品的萃取和净化的方法。在34 mL的萃取池中，填料的装填顺序依次为：2层玻璃纤维膜、无水硫酸钠(干燥剂)、一定量的净化吸附材料(依据样品而定)及样品、0.4 g硅藻土和0.1 g铜粉(用于除硫)的混合物，每层用玻璃纤维膜隔开。对溶剂种类、静态萃取时间、循环次数及温度等萃取参数进行考察。萃取液氮吹干后，由0.5 mL甲醇复溶，过0.22 μm有机滤膜后待测。
1.4 高效液相色谱-三重四极杆质谱仪法检测使用高效液相色谱-三重四极杆质谱仪对样品进行检测。流动相为V(甲醇) ∶V(水)=75 ∶25；流量为0.3 mL /min；进样量为5 μL；柱温为40 ℃；外标法定量。
采用电喷雾电离(ESI)负离子模式；雾化气为氮气(流量3.0 L/min)；加热气为空气(流量10.0 L/min)；干燥气为氮气(流量10.0 L/min)；碰撞气为氩气。接口温度为300 ℃；脱溶剂管温度为250 ℃；加热模块温度为400 ℃。
2 结果与讨论 2.1 检测方法的建立高效液相色谱-三重四极杆质谱仪的ESI离子源优化参数见表 1。使用TCS和TCC混合标准样品及实际堆肥样品对检测方法进行验证，在通道288.8>35.1和314.85>160的质谱图见图 1(a)—(d)。由图 1可见，该通道下TCS和TCC的丰度值较高，实际样品分离度好，无干扰，3 min内即可完成检测。该方法具有快速高效、灵敏度高的优点。
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表 1 ESI离子源优化参数 |
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图 1 TCS和TCC混合标准样品及实际样品在多反应监测(MRM)模式下的色谱图 |
影响加速溶剂萃取-在线净化效率的因素有很多，其中非关键性参数影响较小[26]。非关键参数设定为：静态萃取时间5 min，冲洗体积60%，压力10 342 kPa。工作参数的优化主要集中在净化吸附材料的选择、循环次数、萃取溶剂及温度条件。对工作参数的评估采用样品加标法，TCS和TCC的加标质量分数分别为100和20 ng/g(干重)。
2.2.1 净化吸附材料的选择净化吸附材料的优化主要是对其类型及用量进行优化，目的是尽量多地去除干扰物，提高目标物的回收率。实验中使用了PSA、弗罗里硅土、中性氧化铝、酸性硅胶、酸性硅胶/弗罗里硅土这5种不同的吸附材料，其对应的萃取液的颜色和状态也完全不同。以PSA为吸附材料的萃取液是黄色、有悬浮物的浑浊液体，酸性硅胶、中性氧化铝、弗罗里硅土的萃取液颜色逐渐变浅变透明，酸性硅胶/弗罗里硅土的萃取液最干净。5种吸附材料的回收率均＞80%(图 2)。因此，选择能够更好地去除干扰物，且对目标物吸附较少的酸性硅胶/弗罗里硅土为吸附材料。
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图 2 5种不同吸附材料的回收率(n=3) |
对酸性硅胶/弗罗里硅土的用量进行优化，实验中分别采用了酸性硅胶、弗罗里硅土、样品三者质量比为4 g/5 g/0.5 g，3 g/4 g/0.5 g和2 g/3 g/0.5 g。3 g/4 g/0.5 g比2 g/3 g/0.5 g的色谱图基线低，萃取液颜色更浅，但与4 g/5 g/0.5 g几乎没有差别。因此三者质量比为3 g/4 g/0.5 g可去除杂质，得到干净的待测样品。
2.2.2 萃取溶剂和温度的选择采用了双因素实验，考察萃取溶剂和温度对TCS和TCC回收率的影响。选择不同极性的溶剂作为萃取溶剂，如正己烷、二氯甲烷、甲醇、丙酮、正己烷/丙酮(V ∶V=1 ∶1)和正己烷/二氯甲烷(V ∶V=1 ∶1)。选择丙酮和甲醇是因其作为萃取溶剂时回收率高[29-30]，但实验发现其萃取液颜色较深，基质干扰较多。因此，选择正己烷、二氯甲烷和正己烷/二氯甲烷作为萃取溶剂考察对象，温度选择40，70，100和130 ℃。通常温度越高，溶剂黏性越小，目标物转移到溶剂中的速度越快。但对于某些化合物，有时结果却相反。
萃取溶剂和温度对萃取TCS和TCC的影响见图 3(a)(b)。由图 3可见，以正己烷为溶剂时，回收率较低；以二氯甲烷和正己烷/二氯甲烷为溶剂时，回收率相差不大。由于正己烷/二氯甲烷相对更环保，因此选择其为萃取溶剂。以正己烷/二氯甲烷为萃取溶剂时，温度从40 ℃升高至100 ℃，回收率随之升高，继续升至130 ℃时，反而略有下降，因此选择萃取温度为100 ℃。
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图 3 萃取溶剂和温度对回收率的影响 |
根据已选定的萃取条件，对萃取循环次数进行优化。对加标样品(10，80 ng/g的TCC和50，400 ng/g的TCS)分别进行1，2，3次循环。不同循环次数对高、低质量分数的加标样品回收率的影响见图 4(a)(b)。由图 4可见，对质量分数较低的加标样品，循环次数对回收率影响不大，都能得到较高的回收率。对质量分数较高的加标样品，循环2次比1次回收率明显提高，但增加到3次时，回收率无明显变化，因此选择循环次数为2。
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图 4 不同循环次数对高、低质量分数的加标样品回收率的影响 |
通过测试加标污泥样品(1，10，80 ng/g的TCC和5，50，400 ng/g的TCS)对该方法进行评估。加标样品的回收率和精密度见表 2。由表 2可见，所有样品的回收率均＞90%，且中、高质量分数的加标样品的回收率要高于低质量分数的加标样品。将质量浓度为0.5，5，25，50，100，250和500 ng/mL的TCS和0.1，1，5，10，20，50和100 ng /mL的TCC混合标准溶液按照上述方法进行检测，以浓度为纵坐标，峰面积为横坐标，采用外标法制作标准曲线。根据《环境监测分析方法标准制订技术导则》(HJ 168—2020)，将标准溶液加到与样品相似的基体中，采用相同的样品处理方法和分析方法，对质量浓度为估计方法检出限值3~5倍的样品进行10次平行测定，计算检出限和定量限。方法检出限为2.821倍的标准偏差(RSD)(2.821为自由度为9，置信度为99%时的t分布值)，以4倍检出限作为定量限。其线性范围、相关系数、检出限和定量限见表 3。由表 3可见，TCS和TCC在该质量浓度范围内线性良好。
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表 2 加标样品的回收率和精密度(n=6) |
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表 3 加标样品的线性范围、相关系数、检出限和定量限(n=10) |
采用上述方法对上海某污水厂的含水率为80%的污泥堆肥样品进行定量分析，TCS、TCC、总氮和总碳测定结果见表 4。由表 4可见，冷冻干燥后，总碳占比为3.15 %~3.83%，总氮占比为27.3%~30.5%，TCS和TCC的质量分数分别为1.31~1.51和0.61~0.81 μg/g(干重)。TCS和TCC的质量分数与总碳、总氮之间存在相关关系，随着总碳、总氮占比的增加，其质量分数也随之增大，这与前人的研究一致[31]。
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表 4 实际样品中TCS、TCC、总氮和总碳测定结果 |
采用加速溶剂萃取-在线净化-液相色谱串联质谱法测定污泥堆肥样品中的TCS和TCC，该方法效率高、操作简便，使前处理时间和萃取溶剂用量大大减少。采用优化后的方法，对污泥堆肥样品进行加标回收实验，低、中、高质量分数样品的回收率为90.3 %~99.8%，RSD均＜10%，能够满足实际污泥堆肥样品中TCS和TCC检测的要求。
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