2022, Vol. 14 
2. 清华大学环境学院，环境模拟与污染控制国家重点联合实验室，北京 100084
2. State Key Joint Laboratory of Environmental Simulate and Pollution Control, School of Environment, Tsinghua University, Beijing 100084, China
壬基酚(NP)是一种典型的烷基酚类环境内分泌干扰物，由于其具有雌激素效应，也被称为环境雌激素[1-2]。NP具有较强的亲脂性和难降解性，可以对浮游动、植物等具有急性毒性效应，对水生生物具有雌激素效应和生殖毒性效应[3-6]。有研究表明，NP还会引起人类的认知功能障碍，影响多种癌症和男性生育能力[7-9]。NP主要用于生产壬基酚聚氧乙烯醚(NPEOs)和其他化学物质，NPEOs在使用之后约有60%会进入环境，在微生物和紫外线的作用下最终降解为NP[10-12]。由于NP具有半挥发性，也可通过工业生产过程蒸发到大气中，并通过多种方式在环境介质中迁移转化[13]。近年来，越来越多的研究指出，NP已经广泛存在于自然环境中，在湖泊、河流、海洋、沉积物、污泥、土壤，甚至在饮用水、食品和空气中均被检测到[14-16]。我国于2011年把NP列入《中国严格限制的进出口的有毒化学品名录》，2017年把NP确定为优先控制污染物；日本在2015年把NP加入最新的饮用水标准中并限制其质量浓度为300 μg/L[17]。
传统的NP检测主要基于仪器分析方法，如气相色谱法(GC)、气相色谱-质谱法(GC-MS)、高效液相色谱法(HPLC)等，以及生物分析方法，如酶联免疫吸附试验(ELISA)等[18]。这些方法具有应用普遍、灵敏度高、检出限低等优点，同时也具有预处理复杂、分析成本高、操作人员水平要求高等缺点，难以满足现场检测的工作需要[19]。生物传感技术能够很好地满足微量物质的快速、在线和定量检测要求，已成为该领域的研究重点。目前已有不少研究基于电化学和光学等生物传感器实现了NP的定量检测[11, 20-21]。这些方法虽然拓展了NP的检测手段，但目前基于生物传感方法的NP检测大多不能实现再生，检测成本较高。因此，现基于倏逝波光纤免疫传感器，利用间接竞争免疫反应原理，通过光纤传感元件制备、反应条件优化、实际环境样品检测的研究，建立了一种简便、快速、稳定可靠、界面可再生的NP检测技术，再生次数可达200次以上，将显著降低检测成本。该技术集成免疫分析技术、传感技术和荧光分析技术，具有样品前处理简单、检测时间短、检测费用低等优点，适用于环境样品中NP的快速检测。
1 实验部分 1.1 试剂及仪器 1.1.1 试剂NP包被抗原(NP-BSA复合物)和NP单克隆抗体(北京莱帕克科技有限公司)；Cy5.5荧光染料(美国GE Healthcare公司)；3-巯基丙基三甲氧基硅烷(MTS)、N-琥珀酰胺基-4-马来酰胺-丁酸脂(GMBS)、牛血清蛋白(BSA)、NP(均为分析纯，美国Sigma公司)；其他试剂未经特别注明均由国药集团化学试剂公司提供。一系列浓度梯度的NP标准溶液用10 mmol/L磷酸缓冲盐溶液(PBS缓冲溶液)配置。PBS缓冲溶液(10 mmol/L)、抗体稀释液和0.5%十二烷基硫酸钠(SDS)活化再生液均由本实验室配制。
10 mmol/L PBS缓冲溶液：准确称取8 g氯化钠，0.2 g氯化钾，1.44 g磷酸一氢二钠，0.24 g磷酸二氢钾，加超纯水完全溶解，定容至1 000 mL，用盐酸调节pH值=7.4。抗体稀释液：准确称取3 g酶稳定剂，0.1 g硫柳汞钠，5 g BSA，加10 mmol/L PBS缓冲溶液溶解后，用该缓冲溶液定容至1 000 mL。0.5% SDS活化再生液：准确称取5 g SDS，加超纯水完全溶解，定容至1 000 mL，用盐酸调节pH值=1.9。
1.1.2 倏逝波光纤免疫传感器 1.1.2.1 系统结构倏逝波光纤免疫传感器由本课题组自主研制，主要包括传感系统、流动进样系统和数据处理系统[22]，见图 1。系统原理为，10 mW脉冲激光器发射635 nm激光，经单多模光纤耦合器传导至光纤传感探针，在光纤内部发生全内反射，光纤表面可产生穿透深度为数百纳米的倏逝波，倏逝波激发光纤传感探针表面的荧光物质产生荧光信号，荧光信号经同一根光纤传感探针传导，通过滤光片和光电倍增管转化为电信号，经锁相放大器进行信号放大后，最终被计算机采集处理；光纤传感探针装入直径为2 mm，长度为55 mm的反应池中，液体样品可通过蠕动泵控制输送。系统的液体流通、数据采集和处理均由计算机控制。
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图 1 倏逝波光纤免疫传感器系统结构 |
倏逝波光纤免疫传感器采用间接竞争免疫反应模式检测环境中小分子污染物，具体流程如下：首先，荧光标记抗体溶液与待测抗原溶液等体积混合，进行预反应；随后将混合液通入样品池，剩余抗体与光纤探针表面抗原结合；最后利用0.5%SDS活化液(pH值=1.9)冲洗光纤探针后进入下一个测试周期。所有测试均在室温条件下进行，单个样品的检测周期约为10 min。
1.2 实验方法 1.2.1 抗体荧光标记NP抗体标记Cy5.5荧光染料，具体过程参考文献[23]。用紫外可见分光光度计读取荧光标记的抗体在280和678 nm处的吸光度，通过计算可得抗体上的荧光染料标记比。文献报道抗体的最佳标记比为2~4[24]，本实验制备的Cy5.5荧光标记NP抗体的标记比为2.38。
1.2.2 传感探针修饰光纤免疫传感探针通过共价键偶联的方式将生物识别小分子NP-BSA固定到光纤表面[25-26]。首先，利用Piranha溶液[V(30%水)：V(98%硫酸)=1 ∶3]去除光纤探针表面残留的污染物，同时使探针表面羟基化。在无水条件下，用2%的MTS溶液使光纤探针表面硅烷化。再用0.002 mol/L的GMBS溶液为光纤探针表面引入双功能试剂。随后将光纤探针浸入0.075 mg/mL的NP-BSA包被抗原溶液，4 ℃反应过夜。最后用2 mg/mL的BSA溶液封闭光纤探针表面的非特异性吸附位点，于4 ℃条件下保存备用。
1.2.3 传感探针性能测试(1) 光纤特异性：分别测定1.0 μg/mL的Cy5.5荧光标记NP抗体、1.0 μg/mL的Cy5.5荧光标记BSA与PBS缓冲溶液混合液(等体积)及1.0 μg/mL的Cy5.5荧光标记NP抗体与100 μg/L的NP混合液(等体积)的响应信号值；(2)光纤重现性：在整个实验过程中，每间隔20个检测周期对0.5 μg/mL的Cy5.5荧光标记NP抗体进行1次检测；(3)光纤平行性：分别用2根光纤测定0.5 μg/mL的Cy5.5荧光标记NP抗体5次。
1.2.4 检测条件优化(1) 预反应时间优化：用抗体稀释液配制0.5 μg/mL的Cy5.5荧光标记NP抗体，用PBS缓冲溶液配制100 μg/L的NP标准溶液，上述2种溶液等体积混合，进样时间设定为300 s，改变预反应时间为0，20，60，120，180，240，300和360 s，分别测定倏逝波光纤免疫传感器的响应信号值。
(2) 进样时间优化：选择0.5 μg/mL的Cy5.5荧光标记NP抗体，改变进样时间为50，100，150，200，250，300，350，400，450，500，550和600 s，分别测定倏逝波光纤免疫传感器的响应信号值。
(3) 抗体质量浓度优化：预反应时间和进样时间设定为上述测定结果的最优值，改变抗体质量浓度为0.3，0.5，1.0，2.0和5.0 μg/mL，均用抗体稀释液配制，分别测定添加和未添加100 μg/L的NP标准溶液时，不同抗体质量浓度下的倏逝波光纤免疫传感器的响应信号值。
1.2.5 标准曲线根据检测条件优化确定的最佳预反应时间、进样时间及Cy5.5荧光标记NP抗体质量浓度，进行标准曲线的测定，NP质量浓度选择为0.1，1，10，100，300，1 000，3 000和10 000 μg/L，测定不同NP质量浓度对应的倏逝波光纤免疫传感器的响应信号值。
1.2.6 实际样品的测定及加标回收实验实际水样选择郑州大学自来水和郑州大学眉湖水，采集之后用0.22 μm滤膜进行过滤，测得水样pH值分别为6.8和7.2。然后对2种水样分别进行加标，加标质量浓度(X)为50，100，150和300 μg/L。分别测定2种水样的NP质量浓度(x1)，及加标后水样的NP质量浓度(x2), 计算加标回收率，公式见式(1)。
| $ \text { 加标回收率 }(\%)=\left[\left(x_2-x_1\right) / X\right] \times 100 \% $ | (1) |
每个样品平行测定3次，分别计算加标回收率和相对标准偏差(RSD)。
2 结果与讨论 2.1 光纤免疫传感探针性能光纤免疫传感探针性能测试结果见图 2(a)(b)(c)。由图 2(a)可见，探针表面能很好地结合Cy5.5荧光标记NP抗体，而对Cy5.5荧光标记BSA基本没有结合，且添加NP后可使Cy5.5荧光标记NP抗体的检测信号值降低，表明制备的光纤免疫传感探针具有良好的特异性结合性能。由图 2(b)可见，对光纤完成200个测试周期之内的信号稳定性测试，测试信号的RSD为3.6%，说明光纤具有良好的重现性能，可重复利用200次以上，将大大降低检测成本。由图 3(c)可见，选择2根光纤探针对0.5 μg/mL的Cy5.5荧光标记NP抗体进行测试，检测的平均信号值分别为140和134.4，通过比较平均信号值，得出2根光纤的相对差异为4%，说明不同光纤探针之间具有良好的平行性，有利于光纤探针的批量生产使用。
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图 2 光纤免疫传感探针性能测试结果 |
依次对预反应时间、进样时间及抗体质量浓度进行优化，结果见图 3(a)(b)(c)(d)。由图 3(a)可见，预反应时间为60 s之后，信号值不再下降，说明预反应已达到完全，为了保证各抗体-抗原浓度均可达到完全反应，且尽量减少检测周期，故选择最佳预反应时间为120 s。由图 3(b)可见，进样时间为0~350 s时，信号值随进样时间增加而迅速增加，在350~600 s时，增加速率大大降低，故选择最佳进样时间为350 s。由图 3(c)和(d)可见，随着抗体质量浓度的降低，系统的敏感性逐渐升高，同时系统的信号值也相应降低，为保证系统具有足够的信号值且具有较好的敏感性，选择最佳抗体质量浓度为1 μg/mL。
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图 3 检测条件优化结果 |
抗原抗体的免疫分析通常采用Logistic模型进行拟合[27-28]。本研究是建立在间接竞争免疫反应模式的基础之上，标准曲线的拟合是半对数坐标体系下的反S形曲线，通常采用4参数Logistic模型对曲线进行拟合，拟合公式见式(2)。
| $ y=A_2+\left(A_1-A_2\right) /\left[1+\left(x / x_0\right)^p\right] $ | (2) |
式中：y——系统响应信号值；A1、A2——检测信号的最大、最小值；x——样品中NP的质量浓度；x0——半抑制质量浓度(即IC50值)；p——曲线拐点处切线斜率。定义响应信号有效值的90%对应的质量浓度为该方法的检出限，定义系统检测信号有效值的20%~80%对应的质量浓度区间为线性定量检测区间，定义响应信号有效值的50%对应的质量浓度为该方法的半抑制质量浓度。
倏逝波光纤免疫传感器检测不同质量浓度NP的实测曲线和拟合标准曲线见图 4(a)(b)。标准曲线拟合度R2>0.999, 通过拟合参数计算，NP定量检测区间为41.7~487 μg/L，检出限为20 μg/L，检测方法的IC50值为143 μg/L。
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图 4 不同质量浓度NP的实测曲线和拟合标准曲线 |
本研究与文献报道中NP检测方法的比较见表 1。由表 1可见，本研究利用倏逝波光纤免疫传感器对NP的检测具有较高的灵敏度，传感探针的可重复利用次数多，且该方法检出限低于日本最新饮用水标准中对NP规定的限值(300 μg/L)[17]。
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表 1 与文献报道中NP检测方法的比较 |
实际水样测定及加标回收实验结果见表 2。
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表 2 实际水样测定及加标回收实验结果(n=3) |
由表 2可见，在确定的最佳检测条件下，对2种实际水样进行检测，结果NP均为未检出。对2种水样进行加标回收实验后发现，加标回收率为86%~114%，变异系数＜6.0%，表明利用倏逝波光纤免疫传感器建立的NP检测方法具有良好的精密度和准确度。
3 结语本研究基于自主研发的倏逝波光纤免疫传感器，成功制备了光纤免疫传感探针及荧光标记抗体，通过间接竞争免疫反应，实现了NP的快速检测。该方法具有样品前处理简单、测试周期短、检测费用低等特点。通过检测条件的优化，方法的定量检测区间为41.7~487 μg/L，检出限为20 μg/L，IC50值为143 μg/L。对实际水样的加标回收率为86%~114%，变异系数＜6.0%，能够实现较清洁水样中NP的简单、灵敏、快速检测，为利用生物传感器法检测NP提供了技术参考。此外，所建立的方法灵敏度有待进一步提高，未来可引入信号放大等技术，进一步提升检测方法的灵敏度。通过拓展流通池通道数，进一步实现多指标同时检测的目的。
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