0 前言

磷元素(P)是海洋生产力的基础，是海洋生物生长的重要营养元素^[1]，影响和牵制着海洋发展。磷元素在海洋水体中的主要存在形式有非溶解性的悬浮性颗粒磷、溶解性有机磷和溶解性无机磷。悬浮性颗粒磷主要有悬浮性粒状有机磷和泥沙黏土颗粒胶体吸附的磷2种存在体；溶解性有机磷主要为胶态有机磷；溶解性无机磷主要为磷酸盐，包括多磷酸盐和胶态无机磷^[2]。海水总磷(TP)是指存在于海水中的悬浮性颗粒磷、溶解性有机磷和溶解性无机磷等含磷物质的总和。

人类对生态环境的影响不断加剧，导致海水中含磷量过高，浮游生物繁殖旺盛，水体发臭，透明度降低，这一系列的水体富营养化现象严重危及了海洋生物生存和生态环境^[3-4]。南海海域海水中TP质量浓度为0.003~0.007 1 mg/L^[5]；哈素海水中TP平均质量浓度为0.162 mg/L^[6]。以上海域水体TP质量浓度均超出国家标准《海洋调查规范海水总磷测定过硫酸钾法》(GB/T 12763.4—2007)(以下简称“国标法”)的检测范围，在检测过程中往往需要对样品进行稀释，导致测定过程烦琐，影响测定结果的准确性。

目前海水中TP的测定可概括为2部分：样品前处理和样品测定分析^[7]。样品前处理方法包括：过硫酸钾消解法、微波消解法、光催化法、超声波消解法等^[8-12]；样品测定分析方法包括：钼酸铵分光光度法、流动注射-钼酸铵分光光度法、光谱法、色谱法等^[13-17]。这些方法普遍存在不适用于快速连续测定、成本高昂等问题。样品前处理方法和样品测定分析方法比对见表 1。

针对目前海水TP测定方法存在的缺点，现基于过硫酸根离子氧化磷化合物生成磷酸根离子的原理，利用较为小巧的消解仪代替传统的灭菌锅进行消解，优化海水TP测定的影响因素(氧化剂浓度、还原剂质量浓度、显色剂质量浓度、消解时间)，并以国标法为参考，通过线性拟合、正交验证、置信度为95%的F检验、置信度为95%的t检验等统计学方法，验证方法的准确性与精密度，从而建立一种简便、高效、快速且成本较低的海水TP的测定方法(以下简称“新方法”)。

1 材料与方法 1.1 仪器与试剂 1.1.1 仪器

UV-1800PC型紫外分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)；紧固式LX-B35L自控压力蒸汽灭菌锅(成都宜恒实验仪器有限公司)；LH-25A型智能多参数消解仪(北京连华科技公司)，加热速度为10 min内升至165 ℃，温度范围为45~190 ℃，定时范围为1 min~96 h；18 mm×250 mm消解管(北京连华科技公司)。

1.1.2 试剂

磷酸二氢钾(KH₂PO₄，AR，天津市永大化学试剂有限公司)；三氯甲烷(CHCl₃, AR，西陇科学股份有限公司)；过硫酸钾(K₂S₂O₈，AR，上海沃凯生物技术有限公司)；抗坏血酸(C₆H₈O₆，AR，天津市大茂化学试剂厂)；硫酸(H₂SO₄，AR，西陇科学股份有限公司)；钼酸铵[(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O，AR，天津市大茂化学试剂厂]；酒石酸氧锑钾(KSbO·C₄H₄O₆·1/2H₂O，AR，天津市大茂化学试剂厂)。

所用试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水或等效纯水，配制方法见表 2。文中不同浓度的同种试剂的配制方法相同，在此仅示例与国标法相同浓度的配制方法，其他浓度试剂的配制按照比例配制即可，此处不作赘述。

1.2 实验设计 1.2.1 实验原理

以18 mm×250 mm消解管为反应容器，采用智能多参数消解仪进行消解，用过硫酸钾法处理样品，钼酸铵分光光度法分析样品，设计一个10 mL反应体系的海水TP测定新方法。方法原理为：在酸性、120 ℃高温的条件下，过硫酸钾使海水样品氧化，有机磷化合物转化为无机磷酸盐，无机聚合态磷水解为正磷酸盐；消解过程中生成的游离氯，通过抗坏血酸还原；消解后水样中的正磷酸盐与钼酸铵形成磷钼杂多酸，磷钼杂多酸被抗坏血酸还原为磷钼蓝，然后以酒石酸氧锑钾的存在为前提，进行紫外分光光度(882 nm)测定。

1.2.2 磷酸盐系列标准溶液浓度的确定

为优化海水TP测定新方法，以国标法为基础，将国标法的标准25 mL体系缩小至10 mL体系。采用不同浓度系列的磷酸盐(PO₄^3- -P)标准溶液绘制标准工作曲线，以线性回归相关系数(R²)>0.999为判断标准，确定PO₄^3- -P标准溶液使用浓度系列。

采用表 2中与国标法相同浓度的试剂，绘制标准工作曲线，具体步骤为：(1)在3组各6个消解管中分别移入PO₄^3- -P标准使用溶液0，0.3，0.6，1.2，2.4和3.0 mL，用超纯水稀释至10 mL，混匀，配制成浓度为2.4，4.8，9.6，19.2和24.0 μmol/L的标准系列溶液；(2)加入1 mL过硫酸钾溶液，混匀，旋紧瓶盖，置于消解仪中消解30 min；(3)消解后的水样冷却至室温，加入0.2 mL抗坏血酸溶液，摇匀；(4)加入0.8 mL硫酸-钼酸铵-酒石酸氧锑钾混合溶液和0.2 mL抗坏血酸溶液混匀，显色10 min；(5)显色完毕，以空白做参照，使用紫外分光光度计测定溶液的吸光值；(6)绘制标准工作曲线，求出回归直线方程。

1.2.3 影响因素优化实验设计

为了确定新方法的最佳反应条件，对氧化剂浓度、消解时间、还原剂质量浓度、显色剂质量浓度几个变量进行优化实验。

(1) 氧化剂浓度优化：采用浓度为2.4，4.8，9.6，19.2和24.0 μmol/L的系列标准溶液，各浓度设置6组，分别加入30，35，40，45，50和55 g/L的过硫酸钾1 mL，每组实验设置3个重复，确定氧化剂最佳使用浓度。

(2) 消解时间优化：确定氧化剂使用浓度后，进行氧化时间测定，各浓度设置5组，分别消解10，20，30，40和60 min，每组实验设置3个重复，确定最佳消解时间。

(3) 还原剂(抗坏血酸)质量浓度优化：由于2次抗坏血酸作用的物质不同，需要分别进行检测，各浓度设置4组，分别添加32.4，43.2，54.0和64.8 g/L的抗坏血酸0.2 mL，每组实验设置3个重复，确定还原剂的最佳浓度。

(4) 显色剂(硫酸-钼酸铵-酒石酸氧锑钾)质量浓度优化：硫酸-钼酸铵-酒石酸氧锑钾混合液的体积比为5 ∶ 2 ∶ 1。各浓度设置5组，分别加入17% 的硫酸，22.5，30，37.5，45和52.5 g/L的钼酸铵，1.05，1.4，1.75，2.1和2.45 g/L的酒石酸氧锑钾的混合液0.8 mL，每组实验设置3个重复，确定混合液显色剂的最佳质量浓度。

(5) 显色剂(抗坏血酸)质量浓度优化：各浓度设置4组，分别加入43.2，54.0，64.8和75.6 g/L的抗坏血酸0.2 mL，每组实验设置3个重复，确定显色剂(抗坏血酸)的最佳质量浓度。

1.3 海水TP测定新方法的准确性验证 1.3.1 标准工作曲线的拟合验证

使用浓度为0~24.0 μmol/L的PO₄^3- -P标准溶液，按确定的最优实验条件进行新方法标准工作曲线绘制，根据国标法绘制浓度为0~6.4 μmol/L(线性范围)的标准工作曲线，将以上2种方法绘制出的结果进行线性拟合。为了进一步证明新方法的可行性与准确性，采用正交验证对新方法进行验证，即用新方法和国标法同时测定相同浓度梯度的PO₄^3- -P标准溶液，以新方法测定的结果为纵坐标，以国标法测定的结果为横坐标，进行正交验证。

1.3.2 实际环境样品测定的准确性验证

实际水样采集自广东省茂名市(21.7°N，110.9°E)电白区海水养殖场，采样点位为DB-1、DB-2、DB-3，以及广东冠利达海洋生物公司海水养殖场，采样点位为DB-4、DB-5，采样点位分布见图 1。采集的水样送回实验室后，放置于4 ℃冰箱内保存，并在7 d内测定完毕。使用国标法时，由于水样浓度超出标准的测定范围，对5个水样均做了10倍稀释处理；使用新方法时，由于TP测定适用浓度范围扩大，仅对DB-4、DB-5这2个水样做了2倍稀释处理，其余未稀释。将新方法与国标法的测定结果进行正交检验，以新方法测定结果为纵坐标，以国标法测定结果为横坐标，同时进行置信度为95%的F检验和置信度为95%的t检验，以此验证新方法测定海水TP的可行性与准确性。

2 结果与讨论 2.1 磷酸盐系列标准溶液浓度的确定

根据1.2.2节方法绘制新方法的标准曲线，确定PO₄^3- -P系列标准溶液的浓度，结果见图 2。

由图 2可见，当PO₄^3-P浓度为0~24.0 μmol/L，溶液浓度与吸光度呈线性关系，线性回归相关系数(R²)=0.999 1，线性关系良好，具有较好的准确性和可行性。改变反应体系后的新方法与国标法比较，其线性范围具有延续性。因此，采用0~24.0 μmol/L的PO₄^3- -P标准溶液进行后续实验。

2.2 氧化剂质量浓度优化

使用不同质量浓度的氧化剂(过硫酸钾)对不同浓度的PO₄^3- -P系列标准溶液进行氧化，结果见图 3。由图 3可见，当过硫酸钾质量浓度＜40 g/L时，随着质量浓度增大，吸光度升高；质量浓度=40 g/L时，吸光度达到峰值；质量浓度＞40 g/L时，吸光度下降。当PO₄^3- -P浓度为2.4，4.8，9.6和19.2 μmol/L时，氧化剂对测定结果影响不大。其原因为当过硫酸钾质量浓度偏低时，不能与水样中的有机磷完全反应转化为无机磷，影响后续的显色反应，造成吸光度偏低；当过硫酸钾质量浓度过高时，会使反应体系的酸性过高，对反应具有一定的抑制作用，造成吸光度偏低。因此，过硫酸钾质量浓度选用40 g/L为宜。

2.3 消解时间优化

消解时间是影响有机磷被转化为无机磷酸盐，无机聚合态磷水解为正磷酸盐的重要因素。消解时间对海水TP测定的影响见图 4。由图 4可见，在消解时间为10~30 min时，吸光度随时间的延长逐渐提高；30~40 min时，吸光度趋于稳定；＞40 min时，吸光度开始下降。其原因为消解过程是将有机磷转化为无机磷酸盐，无机聚合态磷水解为正磷酸盐，消解时间直接影响该反应的转化率。若消解时间过短，会导致有机磷转化反应不完全，从而使有机磷无法实现最大程度的转化，造成结果偏低；当消解时间＞30 min，正磷酸盐可实现完全转化。综合考虑实验成本，采用消解时间为30 min为宜。

2.4 还原剂(抗坏血酸)质量浓度优化

为防止游离氯与后续加入的还原剂(抗坏血酸)反应而影响磷钼杂多酸与抗坏血酸的显色反应，必须在显色之前加入一定量的抗坏血酸对游离氯进行还原。还原剂质量浓度对海水TP测定的影响见图 5。由图 5可见，当抗坏血酸质量浓度＜54.0 g/L时，吸光度随着抗坏血酸质量浓度的增加而升高；当抗坏血酸质量浓度=54.0 g/L时，吸光度达到最大；当抗坏血酸质量浓度＞54.0 g/L时，吸光度逐渐下降。因此，还原剂(抗坏血酸)质量浓度选用54.0 g/L为宜。

2.5 显色剂混合液质量浓度优化

消解后水样中的正磷酸盐与钼酸铵形成磷钼杂多酸，磷钼杂多酸被抗坏血酸还原为磷钼蓝，这需要以酒石酸氧锑钾的存在为前提。为了研究显色剂混合液(硫酸-钼酸铵-酒石酸氧锑钾)对海水TP测定的影响，依据国标法中硫酸-钼酸铵-酒石酸氧锑钾混合液体积比=5 ∶ 2 ∶ 1的比例，优化钼酸铵和酒石酸氧锑钾的质量浓度(硫酸在混合液中的主要作用为提供酸度^[16]，因此不做改变)。显色剂混合液对海水TP测定影响见图 6。由图 6可见，当钼酸铵质量浓度为22.5~37.5 g/L，酒石酸氧锑钾质量浓度为1.05~1.75 g/L时，吸光度随混合液质量浓度的增加逐渐提高，当钼酸铵和酒石酸氧锑钾质量浓度为37.5和1.75 g/L之后趋于稳定，此时正磷酸盐已完全转化为磷钼杂多酸，反应达到饱和，若继续增加显色剂质量浓度，对吸光度无显著影响。综合考虑实验成本，采用钼酸铵质量浓度为37.5 g/L，酒石酸氧锑钾质量浓度为1.75 g/L为宜。

2.6 显色剂(抗坏血酸)质量浓度优化

抗坏血酸的还原性能使磷钼杂多酸还原为磷钼蓝而显蓝色，本研究使用不同质量浓度的抗坏血酸对磷钼杂多酸进行还原。显色剂质量浓度对海水TP测定的影响见图 7。由图 7可见，当抗坏血酸质量浓度＜54.0 g/L时，吸光度随着抗坏血酸质量浓度的增加而增加；当抗坏血酸质量浓度为54.0 g/L时，吸光度达到最大；当抗坏血酸质量浓度＞54.0 g/L时，吸光度下降。因此，显色剂(抗坏血酸)质量浓度选用54.0 g/L为宜。

2.7 优化条件下标准曲线的绘制

根据上述实验结果，确定新方法的最佳反应条件为：反应体系10 mL，0.8 mL质量浓度为40 g/L的过硫酸钾，0.2 mL质量浓度为54 g/L的抗坏血酸(还原剂、显色剂)，0.8 mL 17%的硫酸、质量浓度为37.5 g/L的钼酸铵与质量浓度为1.75 g/L的酒石酸氧锑钾混合液(V ∶ V ∶ V=5 ∶ 2 ∶ 1)，消解仪消解氧化时间为30 min。

新方法与国标法的线性拟合结果见图 8。

由图 8可见，2种方法的测定结果与PO₄^3- -P浓度具有很好的线性回归关系。新方法测定结果与PO₄^3- -P浓度的线性回归方程为y= 0.016 9 x- 0.001 2，线性相关系数(R²)= 0.999 9；国标法测定结果与PO₄^3- -P浓度的线性回归方程为y = 0.016 8 x-0.001 1，R²= 0.999 7。新方法与国标法的正交验证结果见图 9。由图 9可见，2种方法的线性回归方程为y = 6.153 1 x + 0.004 1，R²=0.999 2，表明2种方法的结果高度一致。

2.8 新方法的线性检测浓度范围

新方法对海水TP测定的检测浓度范围见图 10。由图 10可见，当PO₄^3- -P浓度范围为0~28.8 μmol/L时，溶液浓度与吸光度呈线性关系，R²=0.999 2；当PO₄^3- -P浓度＞28.8 μmo/L时，吸光度逐渐降低。故新方法的线性检测浓度范围为0~28.8 μmol/L，与国标法中的检测浓度范围(0~6.4 μmol/L)相比，新方法的线性检测范围扩大了4.5倍，明显提高了TP总量的测定上限，能够有效地对TP浓度较高的海水进行测定，节省多梯度稀释的时间和测定成本。

2.9 实际样品的测定以及准确性验证

用新方法与国标法分别测定茂名市电白区的海水样品，结果见表 3。

采用正交验证法，以新方法测定结果为纵坐标，以国标法测定结果为横坐标，对2种方法的测定结果进行正交拟合验证，结果见图 11。由图 11可见，2种方法测定结果的R²=0.999 3，线性关系良好。

为进一步检验新方法测定海水TP的可行性，对上述2种方法的测定结果做F检验和t检验：经置信度为95%的F检验，新方法与国标法测定结果的F检验结果为0.03，小于F表中的4.96(df=1，df=10)，说明新方法与国标法的精密度无显著差异；经置信度为95%的t检验，新方法与国标法的Sig.=0.954 >0.05，说明新方法与国标法所测定的海水样品TP浓度结果无显著差异。因此，采用本方法测定海水样品中的TP是可行的。

3 结语

对于海水TP的测定，新方法将反应体系由国标法的25 mL缩小至10 mL，采用消解仪代替高压灭菌锅进行消解，优化了氧化剂浓度、消解时间、还原剂质量浓度、显色剂质量浓度等影响因素，并参照国标法对新方法的准确性与可行性进行了验证，结果表明新方法的测定结果准确可靠。与国标法相比，新方法的检测浓度范围上限由6.4 μmol/L提高至28.8 μmol/L，大大减少了环境样品测定过程中的梯度稀释操作步骤。新方法反应体系小，检测浓度范围广，实验成本低廉，为海水TP的测定提供了新的选择。