0 前言

水环境中的氨氮以游离氨(NH₃)或铵离子(NH₄⁺)形式存在，是地表水与废水监测的重要指标之一，同时也是国家实施节能减排及污染控制的主要监测指标之一^[1]。水体中氨氮的来源有2个：(1)含蛋白质的物质经微生物的分解产生；(2)工业生产及农业生产过程中产生的含氮废水，如合成氨化肥厂生产和农业施肥等^[2]。氨氮浓度过高会造成淡水水体富营养化，对水中生物的危害极为严重，如造成水中生物急、慢性中毒，中毒表现为水生生物的摄食频率降低，生长发育迟缓，生物产生精神亢奋、严重缺氧等，甚至会导致水生生物死亡。生物中毒的机理是氧在生物细胞间的输送速率降低，造成组织损伤。若水中碱性越强，游离氨的数量越多，则毒性越强^[3-4]。

目前氨氮测定方法较多，主要有四大类：分光光度法(纳氏试剂分光光度法^[5]、水杨酸-次氯酸盐分光光度法^[6]、靛酚蓝分光光度法^[7]和次溴酸盐氧化法^[8])，电化学法(氨气敏电极法^[9]、离子选择性电极法^[10]、蒸馏-电位滴定法^[11]和蒸馏-中和滴定法^[12])，仪器分析法(离子色谱法^[11]、连续流动分析法^[13]、气相分子吸收光谱法^[14]、荧光法^[15]和固相显色-反射光谱法^[16])，酶法^[17]。以上方法在不同方面还有一定的不足，其中分光光度法，如国家标准《水质氨氮的测定纳氏试剂分光光度法》(HJ 535—2009)(以下简称“国标法”)需要清洗大量的玻璃仪器，存在工作量大、耗时较长，且反应体系大、废液量大等问题；电化学法需要对样品进行预处理；蒸馏-中和滴定法的精密度较低；仪器分析法设备较昂贵、维护成本较高。

酶标仪与紫外分光光度计具有相同的理论基础，均利用所测物质在一定波长下的吸光度与物质浓度间的线性关系，从而对所测物质进行定量^[18]。紫外分光光度计测定所需试剂用量较大、操作烦琐，测定样品较多时所需时间较长。酶标仪测定所需试剂少、方便简单、准确性与稳定性高^[19]。针对河流、溪流、污染水体等淡水中氨氮的分析，现采用酶标仪代替紫外分光光度计测定氨氮质量浓度，探究了影响小体系氨氮测定过程的影响因素，通过统计学方法验证其准确度与精密度，建立一种简便、连续、快速且成本低、废液量少的氨氮浓度测定方法(以下简称“新方法”)。

1 材料与方法 1.1 仪器与试剂 1.1.1 仪器

BIORAD imark酶标仪(美国伯乐公司)；DRAGONLAB移液器(北京大龙兴创实验仪器股份公司)。

1.1.2 试剂

氢氧化钠(NaOH，AR)、碘化钾(KI，AR)、碘化汞(HgI₂，AR)均购自西陇科学股份有限公司；酒石酸钾钠(C₄H₄O₆KNa·4H₂O，AR)、氯化铵(NH₄Cl，AR)均购自天津市大茂化学试剂厂。

1.1.3 试剂配制

溶液配制参照国标法，具体配制过程如下。

(1) 纳氏试剂(HgI₂-KI-NaOH)：称取16.0 g NaOH于50 mL超纯水中溶解待用，称取7.0 g KI和10.0 g HgI₂于少量超纯水中溶解待用，将混合液体与NaOH溶液混合，稀释至100 mL后保存。

(2) 酒石酸钾钠溶液(ρ=500 g/L)：称取50.0 g酒石酸钾钠于100 mL超纯水中搅拌溶解，将烧杯放置在加热炉上加热至沸腾以去除氨，静置冷却至室温，用超纯水稀释至100 mL后保存。

(3) 氨氮标准贮备液(ρ_N= 1 000 mg/L)：称取3.819 0 g NH₄Cl于少量超纯水中溶解，用1 000 mL容量瓶稀释定容，冷藏保存。

(4)氨氮标准工作液(ρ_N=10 mg/L)：吸取1.00 mL氨氮标准贮备液于100 mL容量瓶中稀释定容。临用前配制使用。

1.2 实验设计 1.2.1 影响因素优化实验

为了准确建立小体系测定氨氮的方法，优化改进方法的最佳反应条件，对显色剂用量、显色时间、盐度、pH值进行优化实验，均设置2个平行。

(1) 显色剂用量的优化：在室温下，配制质量浓度为0，0.1，0.2，0.4，0.8，1.2，1.6和2.0 mg/L的氨氮工作溶液，各氨氮质量浓度设置4组，每组2个平行，在各质量浓度的氨氮工作液中分别加入酒石酸钾钠10，15，20和25 μL，以及纳氏试剂10，15，20和25 μL进行显色反应，以确定纳氏试剂的最佳使用量。

(2) 显色时间的优化：纳氏试剂投入量相同，在室温条件下对氨氮标准工作液分别以5，10，20，30，60，90和120 min进行显色反应，以确定氨氮显色反应的最佳时间。

(3) 盐度的优化：在氨氮工作液中加入氯化钠(NaCl)改变水体盐度为0，0.25%，0.5%，0.75%，1.5%和3.5%，在纳氏试剂投入量与显色时间一致的前提下，进行氨氮显色反应实验。

(4) pH值的优化：在氨氮标准工作液中加入盐酸(HCl)或NaOH，调节水体pH值为1，3，5，7，9，11和13，在纳氏试剂投入量与显色时间一致的前提下，进行氨氮显色反应实验。

1.2.2 标准工作曲线绘制

参照国标法，绘制标准工作曲线，具体步骤为：(1)在8个圆底离心管(2 mL)中分别加入氨氮标准工作液0，10，20，40，80，120，160和200 μL，用超纯水稀释至1 mL；(2)加入20 μL酒石酸钾钠溶液后混匀；(3)加入20 μL纳氏试剂后混匀放置10 min；(4)颜色稳定后，以空白为参照，用酶标仪在波长420 nm下测量并记录吸光度；(5)以氨氮质量浓度为x，吸光度为y，绘制标准工作曲线，求出回归方程。

1.2.3 纳氏试剂优化实验

纳氏试剂在配置时会出现部分沉淀，在对水体氨氮质量浓度测定实验中，带沉淀的纳氏试剂会使测定吸光值偏高。本实验通过对纳氏试剂进行离心处理(6 000 r/min，5 min)，取上清液保存，保证其他反应条件不变，将原反应条件中的纳氏试剂更改为经离心处理后取上清液保存的纳氏试剂进行实验。对经过离心处理和未经离心处理的纳氏试剂的实验结果建立标准曲线，确定离心处理是否会对新方法结果造成影响。为进一步验证纳氏试剂离心处理的准确度，采用正交验证法，以纳氏试剂未经离心处理组标准曲线中各点的吸光值为横坐标，纳氏试剂经过离心处理组标准曲线中各点的吸光值为纵坐标，进行线性拟合。再对2组标准曲线中各点的吸光值结果进行置信度为95%的t检验，确定2组是否具有显著性差异。

1.2.4 线性范围优化实验

在显色剂用量、显色时间、盐度、pH值的优化条件下，设置标准样品质量浓度分别为0，0.1，0.2，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0，2.4，2.8，3.2，3.6，4.0，4.4和4.8 mg/L，用新方法分别测定各质量浓度样品的吸光度，绘制标准曲线，确定具有良好线性关系的质量浓度测定范围。

1.2.5 小体系测定氨氮的可行性验证

在显色剂用量、显色时间、盐度、pH值的优化条件下，进行新方法和国标法标准曲线的绘制，对2种方法进行线性拟合，确定线性回归关系。为进一步验证新方法测定氨氮的准确性及可靠性，采用正交验证法，以国标法标准曲线中各点的吸光值为横坐标，新方法标准曲线中各点的吸光值为纵坐标，进行线性拟合，确定2种测定方法的拟合程度。再对2种标准曲线中各点的吸光值结果进行置信度为95%的t检验，确定2种方法是否具有显著性差异。

1.2.6 环境样品测定结果的准确性验证

实验样品采集于广东省茂名市茂南区田头屋附近3个淡水养殖池塘和小东江河流。每个点位采集2个水深约0.1 m的表层水体样品。

为验证新方法测定样品的可行性，用新方法与国标法同时分别测定淡水养殖池塘及河流样品中氨氮的质量浓度，对2种测定结果进行F检验与t检验，确定2种方法是否具有显著性差异。新方法测定样品步骤见1.2.2节，根据回归方程计算样品氨氮质量浓度。有基体干扰时需要对水样进行预处理，预处理方法参考国标法。

2 结果与讨论 2.1 显色剂用量的确定

水体中的氨氮质量浓度与纳氏试剂显色反应产生的络合物的色度成正比关系，所以显色剂用量是影响实验结果的一个重要因素。显色剂用量对小体系氨氮质量浓度测定的影响见图 1。由图 1可见，在不同的氨氮质量浓度条件下，显色剂用量为10~25 μL，吸光度随显色剂用量的增加而提高。显色剂用量为10 μL时，吸光度较低，其原因为纳氏试剂用量不足，不能与水体中的氨氮完全反应。显色剂用量为25 μL时，吸光度偏高，其原因为过量的纳氏试剂会与氨氮反应生成颜色更深的沉淀物使液体色度加深。显色剂用量为15和20 μL时，吸光度在同一氨氮质量浓度下没有明显差异，但显色剂用量为20 μL的数据重复性更好，误差更低。因此，新方法选择纳氏试剂用量为20 μL。

2.2 显色时间的确定

显色时间是决定氨氮与纳氏试剂反应程度的一个重要因素。显色时间对小体系氨氮质量浓度测定的影响见图 2。由图 2可见，在不同的氨氮质量浓度条件下，显色时间为5 min时，吸光度偏低，其原因为水体中氨氮与纳氏试剂反应还在进行，水体中氨氮与纳氏试剂反应不充分。显色时间为10~30 min时，吸光度较为稳定，其原因为水体中氨氮与纳氏试剂反应充分，此时吸光度的结果较为准确。显色时间为30 min后，吸光度在低氨氮质量浓度下呈下降趋势，在高氨氮质量浓度下呈上升趋势，吸光度表现为不稳定的状态。因此，新方法选择显色反应时间为10~30 min。

2.3 盐度的确定

水体盐度对新方法测定海水和淡水水样的适用性均有影响。盐度对小体系氨氮质量浓度测定的影响见图 3。

由图 3可见，在不同的氨氮质量浓度条件下，水体盐度 < 0.5%时，吸光度较稳定。水体盐度 > 0.5%时，吸光度随盐度的提高而提高，且氨氮质量浓度越高，盐度对显色反应的影响越明显。因此，新方法仅适用于盐度 < 0.5%的淡水水样。

2.4 pH值的确定

由于氨氮与纳氏试剂反应需要在碱性条件下进行，所以pH值是影响氨氮与纳氏试剂反应的一个重要因素。pH值对小体系氨氮质量浓度测定的影响见图 4。

由图 4可见，在不同的氨氮质量浓度条件下，水体pH值为3~11时，吸光度没有明显变化。在水体pH值=1时，吸光度均趋于0。在水体pH值为13时，吸光度偏高，且氨氮质量浓度越高，pH值对其影响越明显。因此，新方法适用于测定pH值为3~11的水样。

2.5 纳氏试剂离心处理的影响

纳氏试剂离心和未离心2种处理条件下测定氨氮质量浓度的标准曲线见图 5。

由图 5可见，吸光度与氨氮质量浓度具有很好的线性回归关系。纳氏试剂不进行离心处理的条件下，吸光度与氨氮质量浓度的线性回归方程为y=0.181 9x-0.002, 决定系数(R²)=0.999 7；纳氏试剂经过离心处理的条件下，吸光度与氨氮质量浓度的线性回归方程为y=0.182 4x-0.004，R²=0.999 0。

为了进一步说明纳氏试剂经过离心处理对测定结果的影响，采用正交验证法，横坐标为未离心处理的纳氏试剂体系测定的吸光度，纵坐标为离心处理的纳氏试剂体系测定的吸光度，线性拟合结果见图 6。由图 6可见，2种方法的线性方程为y=1.003 4x-0.002，R²=0.999 6。结果表明，2种处理方式下的测定结果拟合度较高，经置信度为95%的t检验，sig.=0.168 > 0.05，说明2种处理方式的测定结果不存在显著性差异。因此，配制纳氏试剂后，可经过离心处理后再使用，可避免纳氏试剂沉淀造成的假阳性实验误差。

2.6 线性检测范围

新方法测定氨氮质量浓度的检测范围见图 7。

由图 7可见，当氨氮质量浓度为0~4.8 mg/L，其与吸光度有较好的线性关系，线性回归方程为y=0.185 5x-0.002 8，R²=0.999 9。当氨氮质量浓度 > 4.8 mg/L时，吸光度增加幅度降低。相对于国标法中氨氮的测定范围(0~2.0 mg/L)，新方法的测定范围扩大了2.4倍，可对较高质量浓度的氨氮样品进行准确有效的测定。

2.7 优化条件下标准工作曲线的绘制

使用质量浓度范围为0~2.0 mg/L的氨氮标准工作液，按照上述确定的实验条件(纳氏试剂使用量为20 μL，反应时间为10 min，盐度＜0.5%，pH值为3~11)，进行1 mL小体系氨氮测定标准曲线的绘制，同时根据国标法绘制50 mL体系的标准曲线，结果见图 8。由图 8可见，2种方法具有很好的线性回归关系。

新方法与国标法测定氨氮标准曲线的正交验证曲线见图 9。

由图 9可见，2种方法的线性方程为y=0.985 4x-0.000 06，R²=0.999 7，表明2种方法的拟合度较高。经置信度为95%的t检验，2种方法测定结果的sig.=0.390＞0.05，2种方法的测定结果不存在显著性差异，说明新方法具有可行性，可信度较高。

2.8 新方法与国标法的交叉验证

对实际水样进行氨氮质量浓度测定，结果见表 1。由表 1可见，经置信度为95%的F检验，新方法与国标法对测定实际样品氨氮质量浓度结果的F值(1.124) < 4.96(查F值表所得，df₁为1，df₂为10)，说明2种方法的精密度无显著性差异。经置信度为95%的t检验，2种方法测定结果的sig.=0.394 > 0.05，2种测定方法的测定结果不存在显著性差异，说明新方法具有可行性。

3 结语

建立了小体系(1 mL)测定淡水中氨氮的新方法，补充了国标法大体系(50 mL)在小体系测定上的空缺。新方法的显色剂用量为20 μL，显色时间为10~30 min，盐度 < 0.5%，pH值为3~11，在6 000 r/min、5 min条件下离心处理纳氏试剂，避免了因纳氏试剂沉淀造成的假阳性实验误差。利用酶标仪代替紫外分光光度计，能够实现连续、快速地测定多个样品的目标。与国标法相比，新方法可节省玻璃仪器的清洗时间，提高工作效率；减少纳氏试剂与酒石酸钾钠的使用量，降低测定成本；大大降低废液量，减少二次污染的风险，节约废弃液处理成本。新方法在测定氨氮质量浓度准确度较高的同时，其检测范围从国标法大体系的0~2.0 mg/L提升到0~4.8 mg/L。综上所述，新方法能够连续、快速地测定水中氨氮质量浓度，节省了测定成本与测定时间，提高了工作效率，适用于实地、实时地测定淡水中氨氮的质量浓度。