0 引言

钴(Co)在人体中是必不可少的过渡金属和微量元素，是维生素B₁₂(钴胺素)和其他生物化合物的常见成分^[1-3]。钴(Co)元素可以刺激人骨髓的造血系统，促进血红蛋白的合成和红细胞数量的增加^[4]。但是当人体中钴离子(Co²⁺)浓度过高，可能会造成严重的身体健康问题，如低血压、骨骼缺陷、红细胞增多症、皮肤过敏和活细胞基因突变，对血液和肾脏也会产生不利影响，并会引起呼吸系统和中枢神经系统疾病^[5-6]。《生活饮用水卫生标准》(GB 5749—2022) 规定饮用水中Co²⁺的质量分数不得超过1.0 ×10^-6[7-8]。环境中过量的Co²⁺会抑制微生物的代谢和生长，土壤中过量的Co²⁺会通过农作物吸收和食物链途径被人体吸收^[9]。因此，开发一种高效的土壤中Co²⁺检测方法具有重要意义。

荧光探针具有灵敏度高、选择性好、响应迅速、操作简便和实时性检测等优点，在检测金属离子方面已经得到广泛的应用^[10]。迄今为止，已经开发出了基于金属-配体配位或化学反应的荧光探针，并成功应用于各种金属离子的检测，如锌离子(Zn²⁺)、钯离子(Pd²⁺)、铝离子(Al³⁺)和铜离子(Cu²⁺)等。Li等^[11]设计并合成了推拉式嘌呤核苷型荧光探针L1，探针L1在水缓冲液中的检测限低，对Pd²⁺具有特定的选择性和灵敏度，因此具有潜在的应用前景。探针L1是首个基于“开-关”型嘌呤核苷的Pd²⁺荧光探针，具有很出色的荧光淬灭特性。Iniya等^[12]通过胺与1，2，4-三唑单元连接的2-羟基-1-萘缩合制备了1种高效的荧光探针。该探针在紫外和荧光检测Zn²⁺时均表现出优异的选择性和灵敏度。从密度泛函理论计算已经获得了探针与Zn²⁺的络合方式。成像实验表明，该探针对细胞内的Zn²⁺可以进行有效检测，具有良好的细胞通透性和生物相容性。Li等^[13]首次报道了一种用于Cu²⁺的新型荧光开启双(二氟硼)-1，2-双(1H-吡咯-2-2基)亚甲基Ⅰ肼(BOPHY)探针。BOPHY显示非常弱的荧光，但是加入Cu²⁺时，该探针可以发出强荧光。该探针对Cu²⁺的检测灵敏度高且选择性强，可用于稀释的人血清中Cu²⁺的检测。此外，BOPHY还在海拉细胞Cu²⁺的成像中得到应用。Guo等^[14]首次合成了在C6处含有冠醚基团的嘌呤类似物，从而拓宽了冠醚化学的范围，并为嘌呤类似物在C6处的修饰开辟了一条新的途径。由此产生的冠嘌呤类似物在水环境中对摩尔浓度极低的银离子(Ag⁺)表现出选择性和高效的信号传导行为。Gao等^[15]设计并合成了1种新型的基于推拉式嘌呤核苷荧光探针L1。探针L1在乙腈/水(V/V=92/8)溶液中对汞离子(Hg²⁺)有很高的灵敏度和选择性，而且检出限低，为7.8×10^-8。同时，探针L1与Hg²⁺的摩尔浓度呈正比，线性范围为0~4×10^-6 mol/L，因此探针L1可用于Hg²⁺的分析。

由于Co³⁺的氧化性很强，氧化电位很高，是强氧化剂，容易被还原，且pH值在0.5左右就可以沉淀水解；而Co²⁺不易被空气氧化，稳定性更好。因此，一般荧光探针检测都以Co²⁺为研究对象。Lee等^[16]通过4-(二乙基氨基)水杨醛和二亚乙基三胺的结合，设计合成了1种简单且易于制备的新型比色化学传感器1。在接近纯水溶液中，存在Co²⁺时，传感器1显示从无色到黄色的颜色变化。为了研究传感器1对Co²⁺的感测机理，进行了紫外可见光谱、电喷雾电离(ESI)质谱和理论计算。传感器1对Co²⁺的检出限为0.65 μmol/L。实际上，传感器1用作带有二氧化硅板的可见测试条，可用于定量检测真实水样中的Co²⁺。因此，传感器1可能是对Co²⁺进行现场和实时筛选的良好替代方法。Zhang等^[17]报道了一种基于水杨酸衍生物的希夫碱L，并将其用作荧光探针以选择性地检测Co²⁺。传感器1在乙醇溶液中对Co²⁺显示增强的荧光响应，从而以高选择性将Co²⁺与其他金属离子区分开。在最优条件下，传感器1对Co²⁺的检测限为7.82×10^-7 mol/L。该探针在检测环境和生理系统中Co²⁺浓度方面有广阔的应用前景。

现合成了1种基于香豆素和嘌呤衍生物，高效且易于制备的荧光探针CMP，并将其应用于土壤中Co²⁺的检测，以期实现高效、快速、准确的分析。

1 实验部分 1.1 实验仪器与试剂

仪器：UV-3010紫外分光光度计(日本岛津公司)；PHS-25C型pH计(杭州奥立龙公司)；BSA124S电子天平(德国赛多利斯公司)；Spectofluorometer FS5荧光光谱仪(英国爱丁堡公司)；S6型硅胶柱(20 cm×1.5 cm，重庆欣维尔公司)。

试剂：实验试剂见表 1。

1.2 探针CMP的合成原理

嘌呤骨架是由咪唑环稠合嘧啶环而成的氮杂环化合物，其环中所有原子共轭、共平面，易发生π电子跃迁。嘌呤环中2，6，8，9位可以通过化学反应接入各种取代基团，结构可变性大，适于结构改造且水溶性好，是合成荧光探针最理想的荧光母体之一。

香豆素及其衍生物由于具有出色的光物理特性(高荧光量子产率)、优异的光稳定性和较低的毒性，因此是理想的荧光团。此外，嘌呤及其衍生物具有识别基团，并且它们的N个原子可以用作优异的配位位点。探针CMP就是一种基于香豆素和嘌呤衍生物的简单、高效且易于制备的新型荧光探针。该探针在4-羟基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲溶液(pH值= 7.4)中对Co²⁺表现出高灵敏度、高选择性和快速的响应(＜1 min)，并且该探针与Co²⁺结合后可以通过肉眼观察到溶液颜色迅速发生变化。

1.3 探针CMP的合成路线

化合物1的合成：在100 mL圆底烧瓶中，加入4-(二乙基氨基)水杨醛(1.93 g，10 mmol)和丙二酸二乙酯(3.20 g，20 mmol)，将其溶解在50 mL乙醇中，然后加入哌啶(1 mL)。将混合物在80 ℃下搅拌6 h。反应完成后，将溶剂旋干。粗产物经硅胶柱色谱纯化，用乙酸乙酯/石油醚(V/V=1/7)作为洗脱剂，得到化合物1，为浅黄色油状物(2.61 g，收率90%)。

化合物2的合成：在100 mL圆底烧瓶中，将化合物1(1.90 g，6.56 mmol) 溶解在30 mL乙醇中，然后加入水合肼(1.64 g，32.78 mmol)，并将混合物在25 ℃下搅拌30 min。冷却至室温，有固体析出，抽滤，用20 mL冰乙醇洗涤3次。获得化合物2，为亮黄色固体粉末(0.50 g，收率27%)。

化合物3的合成：在100 mL圆底烧瓶中，加入5-氨基-4，6-二氯嘧啶(5.00 g，30 mmol)和1-萘胺(8.58 g，60 mmol)并溶于50 mL甲醇中，然后加入5 mL HCl。将混合物在65 ℃下搅拌24 h。冷却后，将溶剂旋干。然后将粗产品溶于1 mol/L的NaOH溶液中，并将混合物用乙酸乙酯萃取3次。有机相用1.2 mol/L的HCl洗涤，然后用饱和NaCl除水，干燥，得到粗产物。粗产物用CH₃OH/H₂O(V/V=1/5)重结晶，得到化合物3，为浅紫色固体粉末(5.75 g，收率71%)。

化合物4的合成：将化合物3(5.00 g，18.50 mmol)，乙酸(5.88 g，98.00 mmol)和十二烷基三甲基氯化铵(0.45 g，10 mmol)溶解在60 mL的三氯氧磷中，然后加入多聚磷酸(25 g，74 mmol)。将反应混合物在80 ℃下搅拌过夜。反应完成后，将溶剂旋干，得到褐色油状物。将冰水混合物加入该混合物中，析出棕色固体，抽滤，干燥，得到粗产物。将粗产物通过硅胶柱纯化，使用CH₃OH/CH₂Cl₂(V/V=1/250)洗脱，得到化合物4，为白色固体(2.53 g，收率50%)。

探针CMP的合成：在100 mL圆底烧瓶中加入化合物2(0.17 mg，0.64 mmol)和化合物4(0.37 mg，1.27 mmol)溶解于30 mL乙醇中，然后加入三乙胺(2 mL)。将混合物在80 ℃下回流搅拌48 h。反应完成后将该溶液冷却至室温，观察到有黄色固体析出，抽滤并用冰乙醇冲洗，得到探针CMP，为棕黄色固体(0.12 mg，收率36%)。

1.4 溶液的制备

HEPES缓冲溶液：在100 mL蒸馏水中溶解0.238 g的4-羟乙基哌嗪乙磺酸，配置成浓度为10 mmol/L的HEPES缓冲溶液。

空白储备液：在500 mL烧杯中倒入300 mL的二甲基亚砜、190 mL蒸馏水和10 mL的HEPES缓冲溶液，配置成0.2 mmol/L的空白储备液，并用1.0 mol/L的HCl溶液和1.0 mol/L的NaOH溶液将其pH值调为7.4。

探针CMP储备液：将探针CMP溶解在二甲基亚砜中，配置成1.0 mmol/L的探针储备液。

金属离子储备液：在蒸馏水中溶解各种金属离子的氯盐，如钠离子(Na⁺)，Zn²⁺，锡离子(Sn²⁺)，三价铁离子(Fe³⁺)，二价铁离子(Fe²⁺)，Pd²⁺，锰离子(Mn²⁺)，钙离子(Ca²⁺)，钡离子(Ba²⁺)，钾离子(K⁺)，镉离子(Cd²⁺)，镁离子(Mg²⁺)，Co²⁺，Cu²⁺，铬离子(Cr³⁺)，Al³⁺，碳酸铯(CsCO₃)，硝酸银(AgNO₃)和硝酸铅[Pb(NO₃)₂]，配置成3.0 mmol/L的金属离子储备液。

2 结果与讨论 2.1 探针CMP的金属离子选择性

在5 mL的离心管中，加入3 mL的空白储备液、30 μL的探针CMP储备液和50 μL的金属离子储备液，得到不同金属离子的探针CMP的测试溶液，静置1 h后进行测试，激发波长=438 nm，发射波长=482 nm。探针CMP(10 μmol/L)中加入50 μmol/L的各种金属离子后荧光光谱响应见图 1。由图 1可见，探针CMP溶液在加入其他金属离子时，如Sn²⁺，Fe³⁺，Fe²⁺，Na⁺，Mn²⁺，Al³⁺，Ca²⁺，Ba²⁺，K⁺，Cd²⁺，Mg²⁺，Cs²⁺，Pb²⁺，Cr³⁺和空白样，在482 nm处会发射出很强的荧光，存在Zn²⁺和Ag⁺时会检测到一些较弱的荧光淬灭，只有加入Co²⁺时，探针溶液的荧光会被完全淬灭。由此可见，探针CMP对Co²⁺具有很高的选择性。

2.2 响应时间的影响

响应时间是探针CMP检测Co²⁺灵敏度的重要参数，因此研究了在0~10 min内，存在Co²⁺时探针CMP在482 nm处的荧光强度。向3 mL的空白样中加入30 μL的探针CMP储备液和50 μL的Co²⁺储备液，每分钟测其荧光强度。响应时间对荧光强度的影响见图 2。由图 2可见，向探针CMP溶液中加入Co²⁺后，荧光强度迅速淬灭至最低，并且在1 min内达到稳定值。由此可见，探针CMP在优化的实验条件下对Co²⁺能够快速反应。

2.3 pH值的影响

为了解检测金属离子的最佳条件，研究了pH值为2.0~12.0时，探针CMP与CMP+Co²⁺的荧光强度。pH值对荧光强度的影响见图 3。由图 3可见，当pH值为7.0~11.0时，在482 nm处探针CMP的荧光强度很高，向其加入Co²⁺后，探针CMP的荧光强度被大大淬灭。由此可见，探针CMP检测Co²⁺的最佳pH值为7.0~11.0。因此，本研究中所有的光谱实验均使用pH值= 7.4的HEPES缓冲溶液。

2.4 紫外可见吸收和荧光光谱响应

探针CMP的紫外可见吸收和荧光光谱响应见图 4。由图 4可见，探针CMP溶液(10 μmol/L)在434 nm处有紫外吸收峰，而加入Co²⁺(50 μmol/L) 后，探针CMP溶液的紫外吸收峰红移至473 nm处，同时探针CMP溶液的颜色从黄色变为粉红色。此外，探针CMP在482 nm处表现出很高的荧光强度，但是，加入Co²⁺后，可以观察到探针CMP的荧光被明显淬灭。由此可见，探针CMP对Co²⁺具有很高的灵敏度，肉眼可见的颜色变化可能是由于探针CMP和Co²⁺之间形成了新的配合物。

2.5 探针CMP对Co²⁺的荧光滴定实验

为了进一步评估探针CMP对Co²⁺的灵敏度，在二甲基亚砜/水溶液中进行了探针CMP对Co²⁺的荧光滴定实验，实验结果见图 5(a)(b)。由图 5可见，随着Co²⁺浓度的增加，探针CMP在482 nm处的荧光被逐渐淬灭，当Co²⁺浓度增加到60 μmol/L时，探针CMP在482 nm处的荧光被完全淬灭，同时，探针CMP溶液的荧光从浅蓝色变为无色。

2.6 方法检出限

基于探针CMP对Co²⁺的荧光滴定曲线图，计算探针CMP的检出限。在荧光下降区域取7个点，以Co²⁺浓度为横坐标，在482 nm处的荧光强度为纵坐标，进行线性拟合，得到直线方程y=24 582.285 72 x+37 805.104 07，决定系数(R²)=0.984 1，结果见图 6。然后再测试10组空白样的荧光强度，记录在482 nm处探针CMP(10 μmol/L) 的荧光强度，计算其标准偏差(SD)。检出限(LOD)根据Stern-Volmer方程计算，LOD=3SD/S，其中S表示直线方程的斜率。经计算，探针CMP的检出限为0.26 mg/kg，说明该探针对Co²⁺有很高的灵敏度。

2.7 方法准确度和精密度

对土壤和沉积物标准样品(GSS-27、GSD-20)，以及实际样品中Co元素的精密度和准确度进行测定，结果见表 2。

由表 2可见，土壤和沉积物标准样品以及实际样品的相对标准偏差(RSD)为1.3%~2.7%，精密度良好。标准样品测定结果均在标准值范围内，准确度良好。说明该方法适用于土壤中Co²⁺的检测。

3 结语

本研究合成了1种基于香豆素和嘌呤衍生物的新型开关荧光探针CMP，并将该方法应用于土壤检测中，通过研究探针CMP对Co²⁺的响应时间，表明该探针可以快速检测Co²⁺；通过研究pH值对探针CMP检测Co²⁺的影响，说明探针CMP检测Co²⁺的最佳pH值为7.0~11.0。通过荧光滴定实验，计算出探针CMP的检出限为0.26 mg/kg，说明探针CMP对Co²⁺有很高的灵敏度。同时对实际土壤样品进行准确度和精密度测定，结果表明，本研究在应用于检测土壤中Co²⁺时具有较高的准确度和精密度。相对于传统酸消解分析法，本方法具有高选择性和高灵敏度，可高效、快速、准确地检测土壤中的Co²⁺，为今后更广泛地运用于空气、水质和食品中的Co²⁺检测提供了有益的参考。