2025, Vol. 17 
多环芳烃(PAHs)是一类具有三致效应的持久性有机污染物，在各种环境介质中广泛存在。PAHs和三氧化氮(NO3)等活性自由基或五氧化二氮(N2O5)分子会发生反应，形成硝基多环芳烃(NPAHs)[1]。此外，化石燃料的不完全燃烧也会产生NPAHs[2]。毒理学研究表明，部分NPAHs的致癌性是多环芳烃的10倍，而致突变性高达多环芳烃的10万倍[3]。目前，已在水、大气和沉积物等环境介质中检出不同浓度水平的NPAHs。Chondo等[4]在日本Asano河检出5种NPAHs，总质量浓度为604 ng/L；Nassar等[5]在埃及Nile河发现了7种NPAHs，夏季和冬季的质量浓度分别为5.23~15.69和6.9~19.69 ng/L。在欧美国家沉积物调查中，Santos等[6]在巴西Paraguaçu河沉积物中测定了27种NPAHs，总质量分数为179.2 ng/g；Witter等[7]对美国宾西法尼亚州中南部城市河流沉积物中NPAHs进行了检测，在35份样品中NPAHs检出率高达100%，质量分数为10.5~82.1 ng/g。NPAHs由于其亲脂性，能够被生物体富集。Sonego等[8]报道了熏鱼和肉制品中NPAHs的质量分数水平，最高达5.64 ng/g，表明NPAHs在生物样品中已有检出。虽然NPAHs的浓度水平普遍较低，但是由于其毒性较高，这些肉制品被人类食用后依然会造成一定的健康风险。由于现有方法的检出限相对较高，因此急需开发生物样品中痕量的NPAHs检测方法。
近年来，生物样品中有机污染物的萃取方法主要包括索氏法、超声法、加速溶剂萃取(ASE)等[9-11]。然而，在处理生物样品时，脂肪会引起基质干扰，影响结果的重复性、稳定性和回收率，因此需要进行净化处理[12]。脂肪的去除通常采用凝胶渗透色谱和(或)固相萃取[13-14]。而ASE可以将吸附剂直接加入萃取池中，同时萃取污染物并去除脂肪，该方法已被用于分析鱼类样品中的多氯联苯[12]。固相微萃取(SPME)技术的原理是基于目标物在气-液两相之间的分配平衡。与传统方法相比，SPME具有操作简单、无溶剂消耗、分析时间短、样品需求小等优点[15]。此外，它能够与气相色谱(GC)、液相色谱(HPLC)和毛细管电泳联用，被广泛应用于环境分析和食品分析等领域[16-18]。该技术在1993年由美国Supelco公司商品化，主要的商品化SPME纤维包括聚二甲基硅氧烷(PDMS)、二甲基硅氧烷/二乙烯基苯(PDMS/DVB)等。SPME涂层由于能够高效富集污染物，与其他方法相比，通常检测限更低。由于NPAHs的环境浓度较低，本研究采用ASE结合SPME技术对鱼肉样品进行前处理，采用气相色谱-串联质谱法定量检测鱼肉样品中的14种NPAHs。
1 实验部分 1.1 仪器与试剂仪器：气相色谱-三重四极杆质谱(GC-MS/MS)联用仪及Dionex 350加速溶剂萃取仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)；冷冻干燥仪(美国Labconco公司)；氮吹仪(上海安谱实验科技股份有限公司)；Rotavapor R-300旋转蒸发器(德国Büchi公司)；磁力搅拌器(美国Corning公司)。
试剂：14种NPAHs标准品，包括2-硝基萘(2-nNap)、2-硝基联苯(2-NB)、5-硝基苊(5-nAce)、2-硝基芴(2-nFlu)、9-硝基蒽(9-nAnt)、9-硝基菲(9-nPhe)、1-硝基芘(1-nPyr)、2-硝基荧蒽(2-nFla)、2，7-二硝基芴(2，7-dnFlu)、6-硝基䓛(6-nChr)、1，3-二硝基芘(1，3-dnPyr)、1，6-二硝基芘(1，6-dnPyr)、1，8-二硝基芘(1，8-dnPyr)和6-苯并[a]芘(6-nBaP)(≥98%，美国AccuStandard公司)；丙酮和正己烷(色谱纯，德国默克集团)；球形硅藻土(美国Thermo Fisher公司)；中性氧化铝、酸性氧化铝及弗罗里硅土(美国Thermo Fisher Acros Organics公司)；高纯氦气以及甲烷气(99.999%，南京天泽气体有限公司)；DB-5MS色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm，美国安捷伦公司)；商用固相微萃取纤维(美国Supelco公司)。
1.2 仪器分析条件GC-MS/MS设置参数如下：载气为高纯氦气(99.999%)；离子源为负化学电离源(NCI)；反应气为甲烷气(99.999%)；进样口温度为260 ℃；离子源及传输线温度均为280 ℃；不分流模式进样，流速为1.0 mL/min。程序升温：初始50 ℃，保持1 min，以10 ℃/min的升温速率升至280 ℃，并保持10 min。溶剂延迟时间为6 min。采用选择反应监测(SRM)模式进行数据采集。14种NPAHs的定性离子、定量离子、保留时间及碰撞能量见表 1。
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表 1 14种NPAHs的定性离子、定量离子、保留时间及碰撞能量 |
野外鱼样(银鱼、草鱼和鲫鱼)取自某河流。在方法建立过程中，生物样品选取了市场购买的草鱼。清洗样品、去皮去骨、取其肌肉、冷冻干燥。随后将样品打碎，并在-20 ℃的冰箱中冷冻保存。取出冷冻干燥后的鱼肉组织样品，将其浸泡于一定量的丙酮中，加入NPAHs混合标准品，将混合溶液充分搅拌均匀。待丙酮挥发干净后，将2.0 g的加标鱼样与3.6 g经过活化-去活化处理的中性氧化铝(吸附剂)混合，然后装入34 mL的萃取池中，萃取池的填充方式见图 1。参考Kong等[19]的研究，设置ASE萃取参数如下：萃取温度为120 ℃，萃取溶剂为二氯甲烷，循环2次，静态提取5 min，冲洗体积为90%，萃取压力为10 mPa。
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图 1 ASE填充示意图 |
参考文献[19]，65 μm PDMS/DVB对NPAHs的萃取效果最佳，因此选择该种SPME纤维用于后续实验。将收集的鱼肉萃取液旋蒸至2 mL后，氮吹至尽干。加入15 mL超纯水，密封涡旋混匀。将含有15 mL溶液的棕色瓶进行浸没式萃取，设置萃取温度为55 ℃，萃取时间为35 min，搅拌速度为1 150 r/min。萃取结束后，样品在进样口温度为260 ℃的条件下进行解吸，持续时间为5 min。
1.5 质量保证与质量控制14种NPAHs的储备溶液质量浓度为10 mg/L，采用丙酮进行稀释。所有储备溶液和工作溶液均储存在棕色玻璃瓶中，4 ℃低温避光保存。玻璃器皿使用前先用甲醇和超纯水进行冲洗，然后在马弗炉中以450 ℃的高温烘烤6 h。在样品处理过程中，每10个样品设置一个空白样品(石英砂)，空白样品中并未检测到目标化合物。同时对每批实际样品开展1次加标回收率实验，加入不同质量分数的标准物质(200和10 ng/g)，测定不同加标浓度物质的回收率，每组浓度做3个平行。
2 结果与讨论 2.1 萃取方式的选择顶空萃取和浸没萃取作为2种常见的SPME萃取方式，其选择主要取决于待测化合物的性质。本研究所选取的高环NPAHs属于半挥发性有机污染物，顶空萃取时化合物从水相转移到纤维相的效果较差，在Kong等[20]的研究中也有同样的结论。因此最终采用直接浸没的方式进行萃取，即顶空体积设定为0 mL。
2.2 加速溶剂萃取吸附剂种类的选择弗罗里硅土和氧化铝是常用的脂肪吸附剂[21-22]，因此本研究对比了经活化-去活化的中性氧化铝、酸性氧化铝及弗罗里硅土对样品加标回收率的影响，加标量为50 ng/g，每个条件进行3次重复试验，取回收率的平均值进行比较，结果见图 2。由图 2可见，加入弗罗里硅土后NPAHs的加标回收率较差，特别是对于高环的化合物，回收率仅在40%左右，中性氧化铝和酸性氧化铝均可获得较高的回收率，但中性氧化铝在脂肪去除方面的效果更佳。有学者对吸附剂的脂肪去除能力进行了研究，Wang等[23]采用酸化硅胶进行净化，得到了无脂肪的提取液，但苊、苊烯和蒽的回收率较低。Holst等[12]研究结果显示，除碱性氧化铝(1.4%)外，其他吸附剂均能有效去除脂肪，与本研究结论一致。综上，后续研究中选择中性氧化铝作为脂肪吸附剂。
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图 2 不同脂肪吸附剂的鱼样加标回收率比较 |
从热力学的角度来看，提高样品溶液的萃取温度可以增加分析物在纤维上的扩散速率，从而提高分析的灵敏度并缩短达到平衡所需的时间[24]。然而，高温下分配系数降低，可能导致分析过程中的灵敏度下降。因此，研究了不同萃取温度(25，35，45，55和65 ℃)的影响，每个条件进行3次重复试验，结果见图 3。
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图 3 不同萃取温度对NPAHs萃取能力的影响 |
由图 3可见，在25~55 ℃下，各种物质的丰度随温度升高而增大，说明该范围内温度的升高有利于萃取过程的发生。当温度＞55 ℃时，各物质基本可以达到萃取平衡，因此选择55 ℃的萃取温度作为最佳条件。
2.4 萃取时间的选择萃取时间对NPAHs的提取效率至关重要。萃取时间受到多种因素的影响，包括分配系数、扩散速率、样品基质、样品体积和纤维性质等。对于分子质量较低的化合物，它们能够在较短的萃取时间内达到平衡，这主要受动力学效应的影响[25]。然而，分子质量较大的化合物则需要更长的平衡时间。因此，选择了不同的萃取时间(15，25，35，45和55 min)进行实验探究，每个条件进行3次重复试验，结果见图 4。
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图 4 不同萃取时间对NPAHs萃取能力的影响 |
由图 4可见，在萃取初始，化合物能够较快地富集于纤维上，富集量迅速增加，当接近于萃取平衡时，吸附速率逐渐减慢，趋于平缓。对于大部分化合物，萃取时间在35 min可达到萃取平衡，但对于低环化合物2-Nap和2-NB，过长的萃取时间反而会使萃取能力下降。因此，最终确定了35 min的平衡时间作为最佳条件。
2.5 离子强度通常情况下，提高离子强度可降低水相中弱极性和非极性化合物的溶解度，促使化合物快速转移到气相中[26]。然而，加盐会影响SPME纤维与样品溶液之间的平衡常数。考虑到本研究采用浸没的方式萃取化合物，加盐不仅会显著影响化合物的水溶性，还会导致极性较小化合物的萃取效率降低[27]。因此后续实验中不添加盐。
3 分析方法评价 3.1 精密度和准确度通过向鱼肉中加入不同质量分数(200和10 ng/g)的14种NPAHs混合标准品。验证方法的线性范围、相关系数、检测限、回收率和相对标准偏差(RSD)，结果见表 2。由表 2可见，NPAHs的线性范围为0.5~500 ng/g，相关系数为0.995 1~0.999 5。基于3倍信噪比计算检测限，范围为0.03~0.7 ng/g。高质量分数加标回收率为61.7%~103%，RSD≤9.2%；低质量分数加标回收率为59.1%~106%，RSD≤12%。
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表 2 鱼样中14种NPAHs的线性范围、相关系数、检测限、回收率和相对标准偏差(n=5) |
实际样品测定结果见图 5(a)—(c)，图中化合物序号同表 1。
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图 5 实际样品测定结果 |
由图 5可见，银鱼、草鱼和鲫鱼中均检测到1-nPyr，质量分数分别为0.45，0.41和0.65 ng/g。此外，在银鱼中还检测到2-NB(1.68 ng/g)、9-nAnt(1.19 ng/g)和6-nChr(0.78 ng/g)，在草鱼中检测到6-nChr(1.28 ng/g)，在鲫鱼中检测到5-nAce(1.38 ng/g)，其他污染物未检出。
4 结语采用ASE结合65 μm PDMS/DVB商用SPME纤维，建立了鱼肉样品的前处理方法，采用气相色谱-串联质谱法测定14种NPAHs。ASE萃取时加入中性氧化铝脂肪吸附剂对脂肪进行在线去除，SPME过程的最佳萃取时间和萃取温度分别为35 min和55 ℃。本方法线性范围为0.5~500 ng/g，相关系数为0.995 1~0.999 5，检测限为0.03~0.7 ng/g。高质量分数加标回收率为61.7%~103%，RSD为2.1%~9.2%；低质量分数加标回收率为59.1%~106%，RSD为1.7%~12%。该方法灵敏度较高，线性范围较宽，可满足对鱼肉中14种NPAHs的常规检测需要。
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