藻类是指在水中营浮游生活的微小藻类植物，包括原核的蓝藻和其他各类真核藻类。藻类是生态监测的重要指标，对水环境变化敏感且具有直观性，能够及时、准确、综合地反映水生态环境状况，具有重要的生物指示作用。藻类种群结构、细胞密度的变化可以展现水环境污染的潜在风险和威胁^[1-3]。洱海作为大理的母亲湖，具有供水、灌溉、旅游、气候调节等多种功能，对生态环境保护具有非常重要的作用^[4]。几十年来，伴随着洱海流域经济社会的快速发展，洱海水质逐步由Ⅰ—Ⅱ类水质标准下降为Ⅱ—Ⅲ类，水体营养水平也从贫营养级逐步过渡到中营养级，并加快了湖泊水体的富营养化进程。洱海自1996年起便不断面临蓝藻水华的威胁，其中1998，2003和2013年等多个年份都出现了大规模的蓝藻水华暴发，而小规模的水华现象更是频繁出现，成为了洱海生态环境的一大挑战^[4-6]。对洱海流域水环境的监测是水华控制研究、湖泊富营养化治理的理论基础和技术支撑。洱海目前正处于富营养化的初期敏感阶段，藻类的变动对洱海水质的影响显得尤为关键和重要^[7]。

目前，藻类的检测方法主要为传统的显微镜人工计数法，该方法对专业人员要求高、耗时长、人为因素影响较大。从20世纪80年代开始，国内外学者相继探索了利用机器视觉与深度学习模拟人眼视觉和大脑，通过智能采集图像，分析辨识藻类的纹理、形态、颜色、生长周期等，对藻类进行快速识别和分类计数的自动检测仪器^[8-13]；利用仪器检测可以打破藻类检测对专业人员的依赖，提高检测效率，更好地满足我国大范围开展藻类监测工作的迫切需求。但目前仪器检测的应用实例不多，特别是对仪器检测结果的准确性、检出限、适用范围、适用条件等研究较少。仪器数据的可靠性是监测工作的关键，开展人工检测比对是考察仪器检测数据可靠性的一种手段^[14]。因此，对洱海流域的藻类进行仪器检测和人工检测数据的比对，探讨和验证仪器的准确性、一致性及适用范围，可为科学合理地利用藻类自动检测仪提供依据。

1 实验方法 1.1 样品来源及制备

于2021年11月—2022年11月，每月采集1次洱海流域(包括洱海、西湖、海西海、茈碧湖、剑湖)样品。取1 000 mL水样于样品瓶中，加10 mL鲁哥氏碘液固定，带回实验室静置48 h后，用虹吸管抽掉上清液，浓缩至200 mL进行分析^[15]。

1.2 分析方法

分析方法包括显微镜人工计数法和AlphaCount 2000藻密度自动检测仪(杭州绿洁环境科技股份有限公司)分析法。显微镜人工计数法按照《水质浮游植物的测定0.1 mL计数框显微镜计数》(HJ 1216—2021)，采用对角线计数法(约160个视野)，人工分类计数每个小方格内所有藻类细胞，并记录下每个小格的分类计数结果^[15]。AlphaCount 2000藻密度自动检测仪分析法是用0.1 mL计数框显微镜计数，通过系统智能控制显微系统移动采集水样图像，对水样中196个视野的藻类进行识别，并自动生成藻类种类与密度分析报告。

1.3 数据统计与处理

采用Microsoft Excel软件统计数据及制作图表。采用SPSS17.0软件计算皮尔森(Pearson)相关系数。

2 实验结果

剔除仪器故障数据，2021年11月—2022年11月获得藻密度自动检测仪比对人工有效数据449组，仪器重复实验有效数据204组，仪器空白实验10组。

2.1 比对结果分析 2.1.1 藻细胞密度

仪器检测与人工检测藻细胞密度变化曲线见图 1。仪器检测与人工检测藻细胞密度的相对偏差见图 2。由图 1和图 2可见，比对的449组样品中，藻细胞密度为74~22 040万个/L(以人工检测数据为基准)，比对结果的相对偏差为-60.64%~86.05%，平均相对偏差为23.78%，正偏差占79.29%，负偏差占20.71%。总体上，仪器检测与人工检测结果变化趋势基本一致，仪器检测藻细胞密度大多较人工检测偏高。

2.1.2 种属鉴别一致性

仪器检测种属数高于人工检测的样品占94.12%，低于人工检测的样品占4.28%，与人工检测相等的样品占1.60%。仪器检测优势种与人工检测一致的样品占41.71%，与人工检测不一致的样品占58.29%。仪器检测与人工检测的种属数基本不一致，仪器检测的种属数大多较人工检测偏高。

2.1.3 相关性

对仪器检测和人工检测藻细胞密度的结果进行相关性分析，相关系数为0.824(P＜0.01)。结果表明，仪器检测与人工检测呈显著正相关(P＜0.01)。

2.2 不同藻细胞密度范围比对分析

将实验结果划分为29个藻细胞密度范围进行比较分析。仪器检测与人工检测的藻细胞密度相对偏差和相关性比对见表 1。由表 1可见，在不同藻细胞密度范围下，仪器检测与人工检测的相对偏差存在差异。藻细胞密度越低，偏差范围越大；藻细胞密度越高，偏差范围越小。平均相对偏差的绝对值为16.18%~31.03%，藻细胞密度为4 000~5 500万个/L，绝对值最小；藻细胞密度为0~500万个/L，绝对值最大。

藻细胞密度较低时，正偏差占比较大，仪器检测值大多高于人工检测值；藻细胞密度较高时，正偏差占比较小，仪器检测值大多低于人工检测值；且随着藻细胞密度的升高，正偏差占比呈降低趋势，当藻细胞密度>10 000万个/L，正偏差占比为0，仪器检测值全部低于人工检测值。

总体来说，仪器检测与人工检测比对结果受藻细胞密度影响较大，藻细胞密度较低时(0~5 500万个/L)，仪器检测结果大多较人工检测偏高；随着藻细胞密度的升高，仪器检测结果较人工检测偏高的占比下降；当藻细胞密度>10 000万个/L时，仪器检测结果全部低于人工检测结果。

从相关性看，仪器检测与人工检测的相关性存在差异，P＜0.01的藻细胞密度范围有15个，P＜0.05的藻细胞密度范围有2个，其余12个藻细胞密度没有明显的相关性。正相关性最好的藻细胞密度范围是500~2 500万个/L。

仪器检测与人工检测的优势种数量与占比见表 2。在29个藻细胞密度范围内，比对样品数＞5的有15个。由表 2可见，仪器检测与人工检测的优势种一致的数量占比存在差异，占比为30.89%~79.17%，占比最高的藻细胞密度为1 000~5 500万个/L，最低的是0~500万个/L。藻细胞密度较低时，优势种一致的占比较小；藻细胞密度较高时，优势种一致的占比较大；随着藻细胞密度的升高，优势种一致的占比呈增大趋势；当藻细胞密度>10 000万个/L，优势种一致的占比又变小。

2.3 仪器重复性分析

用检测仪器对204个样品做了2次重复性实验，相对偏差绝对值为0~94.75%，平均相对偏差为16.47%(图 3)。

2.4 检出限分析

AlphaCount 2000藻密度自动检测仪方法原理与《HJ 1216—2021》一样，因此参照该方法中的随机视野方式的检出限计算方法来计算检出限^[15]。随机视野方式的检出限与观察的视野数、视野面积和计数框面积有关。当浓缩f倍时，按照式(1)计算方法检出限。

$ \mathrm{MDL}=-\frac{A}{n_e \times V \times s \times f} \times \ln 0.01 \times 10^8 $

(1)

式中：MDL——方法检出限，个/L；A——计数框面积，cm²；n_e——观察的随机视野数，个；V——计数框容积，L；s——显微镜1个视野的面积，μm²/个，计算公式见式(2)；f——浓缩倍数；0.01——显著性水平；10⁸——面积换算系数，μm²/cm²。

$ s=\pi \times \frac{d^2}{4} $

(2)

式中：π——圆周率；d——显微镜视野直径，μm，计算公式见式(3)；4——直径和半径换算系数2的平方。

$ d=\frac{\mathrm{FN}}{M_0^{\prime}} $

(3)

式中：d——显微镜视野直径，μm；FN——目镜视场数，mm；M′₀——标准物镜放大率。根据式(1)和检测仪参数值(表 3)，计算出检测仪方法检出限为2.4×10⁴个/L。

采用自动检测仪测定10组纯水，空白实验藻细胞密度为0~13万个/L，平均为4万个/L，参照《环境监测分析方法标准制订技术导则》(HJ 168—2020)附录A，1.1方法检出限的一般确定方法，计算10次平行测定的标准偏差，按公式(4)计算方法检出限^[16]。

$ \mathrm{MDL}=t_{(n-1, 0.99)} \times S $

(4)

式中：MDL——方法检出限；n——样品的平行测定次数，次；t——自由度为n-1，置信度为99%时的t分布(单侧)；S——n次平行测定的标准偏差。

当n为10，置信度为99%时的t值为2.821，计算MDL=11.8×10⁴个/L(＞2.4×10⁴个/L)。仪器空白实验除3个样品外，其他均能误检出藻类，主要原因是仪器将杂质误检为藻类。

3 讨论

目前，仪器检测和人工检测比对的规范、标准主要集中在理化指标的检测方法上，由于显微镜人工计数分析在藻类分析等生物指标检测中的特殊性和复杂性，当前尚缺乏完全适用的比对方法和评价标准，在生物指标检测领域，需要进一步探索和开发适合的比对方法和评价标准，以确保检测结果的准确性和可靠性^[17-18]。通过此次比对实验，从以下方面探讨仪器的准确性、可靠性及适用范围。

3.1 可靠性

(1) 仪器检测与人工检测比对实验的有效数据>400组，统计结果准确性较高。从分析结果看，比对数据的相对偏差较大，但变化趋势总体一致，表明仪器检测在一定程度上可以反映藻类的变化情况。

(2) 在藻细胞密度、种属数上，仪器检测较人工检测结果普遍偏高，优势种一致性也较低。原因包括仪器将样品中的杂质误检成藻类，将不同的藻属鉴定为同一种藻属或将同一种藻属不同形态鉴定为不同藻属，以及仪器计数载体有残留样品等。

(3) 仪器检测对浮游植物的识别、计数存在一定错误，对于含杂质较多的样品，仪器检测的错误会加大。但仪器检测的优势在于检测效率高和数据量大，样本量的提高可以大大提高检测与评价的准确性。

3.2 仪器检测的适用范围

按照划分的29个藻细胞密度范围分析结果看，相关性最好的藻细胞密度是500~2 500万个/L，平均相对偏差绝对值最小的是4 000~5 500万个/L，优势种一致性占比最高的是1 000~5 500万个/L。3项藻细胞密度均不同，而相关性是判定仪器检测与人工检测一致性的首要指标，所以将具有显著正相关性的3个密度范围再进行比较，结果见图 4。由图 4可见，按相关系数为0.56(做图数值为相关系数×100)、平均相对偏差绝对值为22.00%和优势种一致性占比为75.00%来划分参考线值。综合比较，1 000~2 500，1 000~2 000，1 000~1 500，1 000~3 000万个/L为较适宜的藻细胞密度范围。其中1 000~3 000万个/L已包含其余3个范围，因此1 000~3 000万个/L为最适宜检测的藻细胞密度范围。

3.3 仪器检测的相对偏差控值

仪器检测与人工检测比对实验的相对偏差绝对值为0.06%~86.05%，将该值划分为0~15%，15%~30%，30%~45%，45%~60%，60%~75%，75%~90%做频率分布图，结果见图 5(a)(b)。

由图 5(a)可见，全部藻细胞密度范围内，仪器检测的相对偏差绝对值为0~15%的占比最高，75%~90%的占比最低。＜30%的占58.13%，＜45%的占81.29%。由图 5(b)可见，藻细胞密度为1 000~3 000万个/L时，仪器检测的相对偏差绝对值为0~15%的占比最高，45%~60%的占比最低。＜30%的占77.22%，＜45%的占89.87%。所以，AlphaCount 2000藻密度自动检测仪比对人工检测的相对偏差可初步定为±40%。

3.4 仪器重复实验的相对偏差控值

人工检测按照《HJ 1216—2021》的计数要求，每个样品装片计数2次，2次计数结果的相对偏差应在±15%以内。仪器检测相对偏差绝对值为0~94.75%，平均相对偏差为16.47%，从仪器的重复实验结果看，未能达到人工检测的计数要求。所以，AlphaCount 2000藻密度自动检测仪2次计数结果的相对偏差可初步定为±20%。

4 结论

(1) 在洱海流域，AlphaCount 2000藻密度自动检测仪与人工检测的相对偏差为±40%，2次计数结果的相对偏差为±20%。样品浓缩5倍时的方法检出限为2.4×10⁴个/L，在藻细胞密度和种属数上，仪器检测较人工检测结果偏高，但变化趋势总体一致，在一定程度上可以反映藻类的变化情况。

(2) AlphaCount 2000藻密度自动检测仪在进行检测时须调整藻细胞密度，最宜测定的藻细胞密度为1 000~3 000万个/L，在此范围内，有78.26%的样品其优势种与人工检测一致，能够反映水体中藻类种群结构的情况。

(3) 含杂质或植物碎屑多的样品，不宜用仪器检测，应用人工检测。样品藻细胞密度＜500万个/L时，仪器检测结果偏高较多，误差相对较大，应进行浓缩处理后再检测或采用人工检测。样品藻细胞密度＞10 000万个/L时，仪器检测结果偏低较多，应进行稀释处理后再检测或人工检测。

(4) 仪器可对藻类样品进行快速、高效率的鉴定计数，可减少人为因素的影响。基于藻类计数效率与数据可靠性的综合考虑，目前仪器检测适用于对数据精度要求不高的趋势性研究监测，以及应急监测或加密监测的定性、半定量监测工作。

(5) 鉴于洱海流域的特点，藻类种群变化随季节、时间变化较快，仪器检测对部分藻类的鉴定准确率相对偏低，在优势种鉴定和藻密度计数准确度方面有待提升。仪器图谱库须进行更新补充、训练、维护、优化等，仪器检测过程应经常更换载片，确保数据的准确性。