0 引言

严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2，新冠病毒)是造成2019冠状病毒病(COVID-19，以下简称新冠)的病原体^[1]，至今已造成全球近7.8亿例病例和约705万人死亡^[2-3]。其主要通过空气传播^[4]，也有研究证实了新冠病毒存在于粪便中^[5]，并在污水中检测到^[6]。由此，可以基于污水流行病学(Wastewater-based epidemiology，WBE)^[7-8]，对新冠病毒进行监测，推算人群中的新冠病毒感染情况，起到预警预测作用。在疫情早期，荷兰、意大利和美国等国家即基于这一方法对新冠病毒进行监测^[9-13]。相较于全民核酸检测，污水监测的成本大大降低，更为省钱省力，并且污水监测不与人员直接接触，其监测数据反映的是城市区域整体情况，不涉及个人敏感信息。

目前，利用污水新冠病毒预测COVID-19感染数的模型种类较多，不同模型纳入的参数不尽相同^[14-15]。在中国香港的一项关于污水新冠病毒的研究中，运用大量污水人均病毒浓度，通过线性回归开发模型预测疫情趋势，得到了良好的预测结果^[16]，本研究参照此研究进行了相关模型建立。在许多领域的模型预测研究中都应用了精度评价，以了解预测值和实际值的一致性程度^[16-17]。水文模型中常使用一致性指数(Index of agreement)和效率系数(Nash-Sutcliffe efficiency coefficient)作为模型精度评价的指标^[17]，在上述中国香港的研究中将一致性指数(d)应用到了污水流行病学。这一评价指标表示的是预测值与报告值的符合程度，取值为0~1，d值越大，模型预测精度越高^[16-17]。此外，效率系数(E)和均方根误差(RMSE)在许多研究中用于模型预测性能的评估^[16-17]。

本研究对采用相同富集浓缩和检测方法的江苏省2个城市，分别建立线性拟合模型进行新冠病毒感染人数预测，对预测感染人数与报告感染人数的一致性程度进行详细比较，探索这一模式下感染新冠病毒人数预测值与报告值的一致性。

1 材料与方法 1.1 污水采集

选择江苏省A市和B市进行污水采样。选取A市10个可覆盖城市主城区人口的污水处理厂(2023年3—4月为1个，2023年5月底增至9个，2023年6月起增至10个)，采样时间为2023年3月—2024年3月，采用24 h混合采样进行污水收集，采样频率为每周1次。采样期间各污水处理厂日污水处理量为0.40~15.43万t。选取B市9个可覆盖主城区人口的污水处理厂(2023年4月为6个，2023年5月起增至9个)，采样时间为2023年4月—2024年3月，采用24 h混合采样进行污水收集，采样频率为每周2次。采样期间各污水处理厂日污水处理量为1.11~17.25万t。所有污水采集样本于4 ℃条件下保存运输至实验室检测。

1.2 污水新冠病毒富集浓缩(聚乙二醇沉淀法)检测方法

2个城市研究期间的污水新冠病毒富集浓缩方法参照卫生行业标准《污水中新型冠状病毒富集浓缩和核酸检测方法标准》(WS/T 799—2022)中的聚乙二醇(Polyethylene glycol，PEG)沉淀法^[18]。先对污水样本进行预离心，转移上清液至3个新离心管中；分别加入3.5 g聚乙二醇和0.79 g氯化钠进行充分混合，完全溶解后进行二次离心2 h；离心完成后完全弃除上清液。剩余样本再次离心5 min并弃除上清液，吸取0.4 mL无核酸酶水加入到第1个离心管中，经反复吹吸沉淀、瞬时离心后吸出混悬液至第2个离心管中，重复操作再次吸出混悬液至第3个离心管中，继续重复操作至形成最终混悬液，对此混悬液进行核酸提取和实时荧光反转录聚合酶链式反应(RT-qPCR)定量检测。

1.3 污水新冠病毒浓度定量

2个城市研究期间经PEG沉淀法富集浓缩后的病毒核酸检测参照《WS/T 799—2022》中的核酸检测部分进行^[18]。经核酸提取和RT-qPCR检测进行污水新冠病毒的定量。核酸提取过程参照新冠病毒核酸提取试剂盒的说明进行。RT-qPCR选择靶基因ORF1ab和靶基因N双靶标检测，设置3个样本平行，参照新冠病毒核酸检测试剂盒的说明进行。靶基因ORF1ab是新冠病毒基因组中的一部分，其表达产物与病毒的复制和感染过程紧密相关，在后续模型建立中选择其检测结果进行数据处理。

1.4 新冠报告感染人数

自2023年开始，江苏省A市和B市新冠病毒感染报告人数通过哨点医院监测网络每周上报，统计来源为2市各医院新冠病毒感染确诊病例的合计值。

1.5 新冠感染人数模型预测与精度评价

首先，分别计算各污水处理厂污水中每个采样日的靶基因ORF1ab新冠病毒总拷贝数，即各污水处理厂日污水处理量乘以靶基因ORF1ab污水新冠病毒浓度。再以每周一为1周开始，进行每周所有污水处理厂新冠病毒总拷贝数的汇总，最后取病毒拷贝数周平均值，本文周平均值如ORF1ab基因周平均拷贝数等，均为每周合计值除以7得到的每周的日平均值。同样，对新冠报告感染人数进行周平均值的计算。采用小数点向上取整，将人数统一为整数。以这2个周平均值变量进行线性拟合，考虑到人数计算，线性拟合模型过零点。分别得到A市和B市的线性拟合方程，利用得到的方程进行2市新冠感染人数的预测。

得到的预测值与实际报告值进行比较，应用R语言(4.3.2版本)进行d、E、RMSE和斯皮尔曼(Spearman)相关系数(r)的计算，对线性拟合模型预测新冠感染人数进行精度评价。d值和E值的计算参考先前文献中的公式进行计算^[17]。应用R语言进行正态性检验，若不符合正态分布，再采用Spearman相关性分析。将每周的周平均预测感染数除以周平均报告感染数，得到每周预测值与报告值的相差倍数，进一步计算得到研究期间所有的相差倍数平均值和最大值。

2 结果分析 2.1 污水新冠病毒检出情况

研究期间，从2023年第10周至2024年第13周，A市污水共收集样本478份，检出阳性248份，阳性率为51.9%。从2023年第15周至2024年第13周，B市污水共收集样本882份，检出阳性761份，阳性率为86.3%。A市和B市周平均靶基因ORF1ab新冠病毒拷贝数和周平均报告感染人数见图 1(a)(b)，2个曲线图中的所有曲线采用了3次样条曲线。由图 1(a)可见，研究期间A市的新冠病毒周平均拷贝数和周平均报告每日新冠新增感染人数均有3处较大的波动，且二者出现的时间接近。由图 1(b)可见，研究期间B市同样出现3个较大波动，且二者出现的时间接近。由此提示，这些时间段的城市人群新冠感染可能处于暴发阶段，污水中的新冠病毒浓度可以反映新冠感染程度，二者呈正相关。

2.2 线性拟合模型预测

A市和B市污水新冠病毒总拷贝数与其对应的新冠报告感染人数的线性拟合见图 2(a)(b)，均为周平均值。2个城市通过原点的线性拟合公式如下：

$ \text { A 市: } y=0.6886 x\left(R^2=0.690\;1\right) $

(1)

$ \text { B 市: } y=1.0244 x\left(R^2=0.690\;2\right) $

(2)

式中：x——污水新冠病毒ORF1ab总拷贝数周平均值；y——新冠报告感染人数周平均值；R²——线性拟合的拟合优度，越接近于1，其拟合结果越好^[19-21]，A市和B市的R²均达0.69。

根据得到的线性拟合公式，用2个城市每周的污水新冠病毒ORF1ab拷贝数平均值计算新冠感染人数周平均值的预测值。A市和B市新冠感染人数周平均值的预测值和报告值的变化趋势见图 3(a)(b)，图中的所有曲线采用了3次样条曲线。

由图 3(a)(b)可见，均有3个明显的波，在新冠报告感染人数增多或下降的时间和整体趋势上，由污水病毒浓度结合线性拟合方程得到的预测值与报告值的增多和下降趋势相近。2个城市除了第1个波的报告值整体大于预测值，其余2个波的预测值整体大于报告值。2个城市新冠感染人数周平均预测值的小波动较少，相对报告值更稳定，A市的新冠感染人数周平均报告值浮动较B市更多，A市和B市新冠感染数周平均报告值和预测值范围均在0~300人。在趋势预测方面，除2个城市的第1次波峰未能准确预测，第2，3次波的预测值先于报告值出现，可以达到预测目的；在具体感染人数方面，预测值峰值与报告值峰值较为相近，可依此估计城市当前新冠感染的严重程度。A市和B市可在无需进行人群核酸检测的情况下，利用污水流行病学进行新冠疫情峰值的预测预警。

2.3 2个城市模型预测精度评价

对A市和B市线性拟合模型得到的周平均预测值与网络每周上报的感染人数周平均值进行比较，考察报告值与预测值的一致性程度。夏皮罗- 威尔克(Shapiro-Wilk)正态性检验结果见表 1。

A市和B市正态性检验p值均＜0.05，不符合正态分布，因此采用Spearman相关性分析。对A市与B市线性拟合模型预测精度进行评价，结果见表 2。

在d、E和r这3个评价指标上，A市和B市都表现出较好的一致性，且这3个评价指标在2个城市显示出相近的数值。A市和B市的d值都可达到0.85，接近1，一致性好；A市E值达0.57，B市E值达0.59，均＞0，接近0.6；Spearman相关系数r分别可达0.86和0.73，也较接近1，预测感染数和报告感染数匹配较好。但是，A市和B市的RMSE均＞30，显示出较差的一致性。A市和B市新冠感染预测值与报告值的平均相差倍数分别为1.15倍和2.46倍，最大相差倍数分别为6.00和12.00倍。

3 讨论

目前，国内外基于污水流行病学的新冠病毒研究主要集中于污水新冠病毒监测和方法优化以及对新冠感染人数的预测^[22-25]。其中，对新冠感染人数的准确预测是影响政府和医务工作者应对疫情变化的重要参考。对新冠流行程度的预测需要掌握模型预测值与实际值的差距，并了解这一差距在不同城市的表现是否相同。

3.1 污水新冠病毒检出阳性率差异

A市每周1次污水采样中新冠病毒阳性率为51.9%，与一项Meta分析中随机效应模型的城市污水样本SARS-CoV-2总体阳性率(53.7%)分析结果接近^[26]。B市每周2次的采样中阳性率达86.3%，相对较高，但亦与一些文献结果相近，如Saththasivam等^[27]在卡塔尔和Kumar等^[28]在印度的研究结果接近甚至超过90%的阳性率。本研究中的2个城市的阳性率在现有文献阳性率的范围内，但A市和B市污水样本新冠病毒阳性率结果相差较大。同一个城市每个污水处理厂采样次数相近的情况下，在采样点方面，A市检出的样本更集中于其中的3个采样点，B市的污水阳性率覆盖采样点和采样时间更广。在采样日期方面，A市在研究期间有4个月的未检出数超过30份，在B市有2个月，且A市的采样频率低于B市。A市与B市的采样频率每周相差1次，将每周的采样结果视为该城市感染者每周排入污水处理厂的靶基因ORF1ab总拷贝数。该方法忽略了采样频次对拟合结果的影响，在后续深入的研究中可统一采样频率进行更为标准的比较。以上都是可能影响A市与B市污水阳性率差异的原因。同时，与其他污水新冠病毒研究相似，本研究采用PEG沉淀法富集浓缩污水中新冠病毒以提高检测的灵敏度，再用RT-qPCR进行定量检测^{[22, 29]}。

3.2 新冠感染人数的预测模型

目前，利用污水流行病学进行预测预警的模型种类较多，暂未有统一的模型对新冠感染人数进行预测，较为基础的几种模型有蒙特卡罗模拟、人工神经网络(artificial neural network，ANN)模型和基于这些基础模型的优化模型等。蒙特卡罗模型的应用广泛，其中澳大利亚污水中第1次检测到新冠病毒的研究就利用蒙特卡罗模型对新冠病毒感染人数进行了中位数估计^[30]。美国的一项研究利用ANN模型不仅能准确估计流行率和发病率，还预警了2~4 d的发病率，但与此同时，该研究发现SARS-CoV-2 RNA浓度或病毒载量与COVID-19病例数之间的相关性有限，需要结合其他相关变量才能准确预测病例数^[14]。以上2种模型的预测预警能力较好，但其建立需要大量数据，本研究采用简单的线性拟合模型，使用较少的数据量，同样可以达到所需的预测预警效果。研究发现在A市和B市利用污水数据和线性拟合模型，其预测值和报告值接近，此预测值可能更接近医院确诊感染数，城市实际感染人数可能远大于此预测值。本研究的新冠报告感染人数来自江苏省各哨点医院的报送确诊数，未经医院确诊的有症状和无症状病例数未计入，所以其数值应小于相应城市实际感染人数。但同时，经医院确诊者可能是感染人群中症状相对更严重的人员，医院确诊人数的增多也可反映该区域整体感染情况的上升；所以预测结果仍然可以提前预警疫情状况，为医务工作者和居民提供信息，为可能出现的疫情暴发预先做好准备。

3.3 污水中病毒和新冠感染人数的变化

A市的靶基因ORF1ab新冠病毒在2023年第30—33周和2024年第9—12周，B市的靶基因ORF1ab新冠病毒在2023年第35周和2024年第6—9周分别到达第2、第3个较大波，2个城市的波动时间接近，提示在这段时间整个江苏省区域新冠病毒感染增多。A市在2023年第22—24周，B市在2023年第19—20周都分别达到了研究期间污水病毒浓度的最高峰，也是第1次较大的波，但此时新冠报告感染数变化趋势先于污水新冠病毒上升(图 1)，其原因可能是受制于PEG沉淀法的富集浓缩回收效率，本研究采用的PEG沉淀法回收率为20%左右，但在实际计算中忽略了回收率的影响，视其为100%。回收率是影响准确估算病毒浓度的重要影响因素^[31]。在将来的污水流行病研究中可以采用富集能力更好，回收率更稳定的新冠病毒富集浓缩方法。图 3显示A市和B市在第1个峰值时，感染人数周平均报告值均高于预测值，可能有2个原因：一是第1个峰出现前为研究初始阶段，污水处理厂数量比研究最终的数量少，ORF1ab基因拷贝数也较小，因此在第1个峰值时，出现新冠感染人数周平均报告值高于预测值的情况；二是受回收率对ORF1ab基因周平均拷贝数的影响，从而影响预测值的计算；其中第1个原因的可能性更大。

3.4 预测模型精度评价

过原点的线性拟合模型基于污水新冠病毒周平均拷贝数对新冠病例的预测，与各医院报告的周平均感染人数，d、E和r指标的一致性较好，RMSE差别较大，其原因可能是此数值会过高地估计误差，当存在偏离程度较大的点时，会对RMSE产生较大的影响，但预测值和报告值一致性较差的结果也应考虑。理想的模型应当是精度评价指标所表示的一致性均较高的模型，此模型下的预测值与报告值间的差距更为可信。2个城市的预测值与报告值相差1~2倍左右，表明利用污水病毒信息结合线性拟合模型可以预测新冠感染人数，且在不同城市间差距相似。这一预测值离真实感染人数还有一定的差距，例如，美国的一项研究模型估计未报告的新冠病例比率大约是确诊病例的11倍^[32]。未来可以深化模型或开发预测能力更好的模型，以预测整个城市的真实感染人数，并且需要纳入更多的城市，以验证不同城市预测值和真实值间的差距变化。若差距相似，则可了解报告值与未报告值的比例，帮助快速预测城市感染人数；若差距不同，则可进一步研究影响不同城市预测值和真实值间差距的因素。

4 结论

2023年3月—2024年3月，A市和B市的新冠病毒周平均拷贝数和周平均报告每日新冠新增感染人数较大的波动出现的时间接近，这些时间段的城市人群新冠感染可能处于暴发阶段。对2个城市新冠感染人数的预测值与医院报告值大多数情况下相近，少数情况下，相差较大。第2，3次波的预测值先于报告值出现，预测值峰值与报告值峰值较为相近，这2个城市可在无需进行人群核酸检测的情况下，利用污水流行病学预测预警新冠疫情的变化。模型的一致性评价结果表明，2个城市在d、E和r这3个评价指标上表现出较好的一致性。

总体而言，基于污水流行病学，采用污水新冠病毒监测结合线性拟合模型的方法，可以对新冠感染人数进行良好预测，并且在2个城市间预测值与报告值表现出相近的倍数关系，未来可为快速预测城市真实新冠感染人数提供参考。