喹诺酮类抗生素(QNs)，又称为吡酮酸或吡啶酸类，主要有氧氟沙星、左氧氟沙星和诺氟沙星等，属于广谱抗菌药，其特点是抗菌活性强、吸收好、少有交叉耐药，早期主要用于疾病医疗和畜牧业^[1-3]。近年来，随着水产养殖业快速发展，养殖模式转变为规模化养殖，大量投饵和滥用抗生素等使养殖水环境污染加剧^[4-5]。有研究表明，约52%的抗生素被用于畜牧业和水产养殖^[6]，其在养殖尾水中的残留会引发环境风险^[7]，特别是对人体健康的潜在威胁日益引起广泛关注^[8]。

目前针对环境水体中抗生素，国家尚未发布统一的监测方法标准，水体中抗生素的研究分析主要采用液相色谱法，具体分为固相萃取-高效液相色谱-荧光检测法(SPE-HPLC-FD)、固相萃取-高效液相色谱-紫外检测法(SPE-HPLC-UV)和固相萃取-液相色谱-串联质谱法(SPE-LC-MS/MS)^[9-11]，其中SPE-LC-MS/MS以高选择性的质谱作为检测器，检测灵敏度高、选择性好、准确度高，可以同时测定多种抗生素类污染物^[12-13]。近年来，超高效液相色谱-质谱法广泛应用于各种抗生素痕量测定，李双双等^[14]基于超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)建立了地表水中18种头孢菌素的高灵敏分析方法，能有效识别和定量分析地表水中头孢菌素的痕量浓度。仲伶俐等^[15]建立了固相萃取技术结合超高效液相色谱-串联质谱法测定地表水中16种大环内酯和林可酰胺类抗生素，该方法测得的线性关系好，加标回收率高，精密度和准确度均可满足地表水中痕量残留的检测要求。

本研究聚焦于16种喹诺酮类抗生素，采用固相萃取与超高效液相色谱联合三重四极杆质谱，构建了一套针对养殖尾水环境中喹诺酮类抗生素的分析体系。选择江苏盐城3家典型的养殖区水产养殖尾水进行实样检测，以期为渔用喹诺酮类抗生素监管提供数据支撑。

1 实验部分 1.1 仪器耗材与试剂 1.1.1 仪器耗材

仪器与耗材见表 1。

1.1.2 试剂

实验试剂见表 2。

标准溶液配制：用甲醇将100 mg/L的16种喹诺酮类混标溶液和诺氟沙星-D5内标溶液稀释100倍，配制成质量浓度为1 000 μg/L的混标和内标使用液，将2种使用液合并。用体积分数为0.5%的甲酸-5 mmol/L甲酸铵溶液与甲醇以90 ∶ 10的体积比混合，用其将使用液稀释至所需浓度。

1.2 样品采集与处理 1.2.1 样品采集

分别对3家典型的养殖区水产养殖尾水每月进行1次采样监测，采样时间为2023年10月—2024年3月。

使用1 000 mL磨口或具聚四氟乙烯内衬垫瓶盖的棕色玻璃瓶采集水样，水样经盐酸调节pH值≤2后在4 ℃下冷藏、密封、避光保存，7 d内完成萃取后，萃取液于-15 ℃下冷冻、密封、避光保存，并在20 d内完成分析。

1.2.2 样品处理

依次用6 mL甲醇、6 mL纯水和6 mL盐酸溶液将固相萃取柱完全浸泡进行活化。水样经0.45 μm混合纤维素(水系)微孔滤膜过滤后取1 000 mL，加入1 g乙二胺四乙酸二钠，以10 mL/min(约3~4滴/s)的流速通过固相萃取柱，上样完毕后用6 mL甲醇溶液(V_甲醇 ∶ V_水=1 ∶ 19)淋洗固相萃取柱，氮气吹干，再用10 mL体积分数为0.1%的甲酸-甲醇溶液以1 mL/min的流速洗脱，用洁净试管收集洗脱液。用浓缩装置把洗脱液浓缩至近干，加入内标使用液10.00 μL，用初始流动相定容至1 mL，用涡旋混匀器混匀后经0.22 μm滤膜过滤，置于样品瓶中，待测。

1.3 仪器条件 1.3.1 色谱条件

采用BEH C18色谱柱(1.7 μm，2.1 mm×100 mm，美国Waters公司)，流速为0.2 mL/min，进样量为10 μL，流动相A为0.5%甲酸-5 mmol/L甲酸铵溶液，流动相B为甲醇。色谱洗脱程序见表 3。

1.3.2 质谱条件

采用电喷雾离子源(ESI)，并设置正离子检测模式(ESI+)进行扫描。数据采集采用了高度选择性的多反应监测模式(MRM)。此外，离子源电压为5 500 V，源温度为550 ℃，气帘气CUR压力为1.72×10⁵ Pa，雾化气GS1压力为3.45×10⁵ Pa，辅助气GS2压力为3.45×10⁵ Pa，碰撞气CAD压力为4.14×10⁴ Pa。优化后16种喹诺酮类抗生素的质谱参数见表 4。

1.4 质量保证与质量控制

实验室质控通过校准曲线、实验室空白、平行样和基体加标来控制。标准曲线的相关系数应≥0.995，或相对响应因子的相对标准偏差(RSD)≤20%，且每20个样品或每批次样品(＜20个)应测定1个标准曲线中间浓度点的标准溶液，其测定结果与该点浓度的相对误差应在±20%以内。实验室空白测定结果应低于方法检出限，平行样的相对偏差应在±25%以内，基体加标回收率应在40%~150%之间。

按照质谱参考条件(表 4)中确定的母离子与子离子进行监测，目标化合物保留时间的相对偏差的绝对值应＜2.5%，且待测样品中各目标化合物定性离子相对丰度(K_sam)测定结果的偏差应保持在规定的最大容许范围内^[16]。定性确证时离子相对丰度的最大允许偏差见表 5。

2 结果与讨论 2.1 方法优化 2.1.1 前处理条件优化 2.1.1.1 固相萃取柱的选择

通过前期查阅资料文献，重点考察了HLB柱^[17-18]，HLB填料主要是由亲脂性二乙烯苯和亲水性N-乙烯基吡咯烷酮单体组成的一种大孔共聚物，可以通过不同比例组合达到亲水与疏水的目的，从而萃取出不同极性的化合物。用HLB柱对16种喹诺酮类化合物进行空白水样加标回收实验，具体实验操作为：量取1 000 mL纯水，准确加入1 000 μg/L的16种喹诺酮类标准溶液使用液10 μL，按照1.2.2节进行样品处理，与绘制校准曲线相同的仪器分析条件进行测定，测得回收率在70%~120%之间，符合实验要求，因此选择HLB固相萃取柱。

2.1.1.2 洗脱溶剂的选择

固相萃取柱的活化：分别用甲醇和纯水活化以及用甲醇、纯水和盐酸活化。结果显示，在酸性条件下，活化过的小柱洗脱效率要高于只用甲醇和纯水活化的小柱。

为了确保目标化合物能够被充分有效地从样品中分离出来，本研究进行比对实验来选出最优的洗脱条件。分别用纯甲醇、含有0.1%甲酸的甲醇溶液，以及添加了5%氨水的甲醇溶液对空白样品进行高、中、低质量浓度的加标回收实验，评估3种条件下的洗脱效率，结果见图 1。由图 1可见，0.1%甲酸+甲醇对各物质的洗脱效率最好，回收率可达80.5%~106.9%，而5%氨水+甲醇的回收率为61.9%~93.5%，甲醇的回收率为65.2%~105.4%，其效果均不如0.1%甲酸+甲醇。

2.1.1.3 定容溶液的选择

洗脱完成后，将洗脱液浓缩至近干，分别用甲醇，0.1%甲酸+甲醇以及等比例配制的0.5%甲酸-5 mmol/L甲酸铵+甲醇溶液(初始流动相)对洗脱液进行定容，定容体积为1 mL。3种不同定容溶液的空白总离子色谱(TIC)图见图 2。由图 2可见，用初始流动相定容的样品基线噪音较低且平稳，与标准使用液即校准曲线的配制保持一致。故选择0.5%甲酸-5 mmol/L甲酸铵+甲醇溶液作为定容溶液。

2.1.2 仪器条件优化 2.1.2.1 流动相的选择

分别考察0.5%甲酸-5 mmol/L甲酸铵+甲醇、0.1%甲酸+甲醇和0.1%甲酸+乙腈3种流动相的分离效果。3种流动相的TIC图见图 3(a)—(c)。由图 3可见，流动相为0.1%甲酸+乙腈时，各组分物质出峰时间集中在4~8 min，各物质峰过于紧密，且部分物质分离效果不好，无法达到要求。流动相为0.1%甲酸+甲醇或0.5%甲酸-5 mmol/L甲酸铵+甲醇时，出峰时间集中在5~10 min，物质峰相对分散且峰线条平滑，峰型高尖，分离效果相对较好，其中流动相为0.5%甲酸-5 mmol/L甲酸铵+甲醇时，各组分物质的响应值相对更高，所以优先选择其作为流动相。

2.1.2.2 时间梯度的优化

喹诺酮类抗生素基本都是在有机相增大的过程中洗脱出来的，但是有机相初始比例设置和增加速度的快慢都会影响分离效果。有机相增加速度过快会影响样品基线的稳定，增加速度过慢又会引起物质粘连、分离不开，而且梯度时间过长会增加批次样品的完成时间，使快速出具实验数据的效率降低。因此，经过反复实验调整，令有机相在1~12 min由10%增加到98%，此过程中，16种喹诺酮类抗生素在15 min内全部被分离，实验时长适中，优化后16种喹诺酮类抗生素的提取离子图见图 4。

2.2 方法性能

以目标化合物质量浓度为横坐标，以与其对应的峰面积(或峰高)与内标物峰面积(或峰高)的比值和内标物质量浓度的乘积为纵坐标，通过最小二乘法建立相关标准曲线，标准系列质量浓度梯度依次选择0，0.02，0.05，0.10，0.50，1.00，2.00，5.00，10.0，20.0，50.0，100 μg/L，内标质量浓度选择10.0 μg/L。根据响应不同，选择质量浓度范围不同。16种喹诺酮类抗生素的线性关系见表 6。由表 6可见，在检测灵敏度方面，OXA、NAA和FLU这3种化合物展现出最高的响应值，其线性范围下限可达0.02 μg/L；而SPA与ORB的响应值稍低，但依然能在0.05 μg/L的低质量浓度水平保持良好的线性关系；相比之下，NOR与DAN的响应值最低，线性范围下限为0.1 μg/L。其余化合物的响应表现各异，线性范围下限覆盖了0.02 ~0.1 μg/L的区间。16种喹诺酮类抗生素均展现出较好的线性关联性，相关系数分布在0.998 4~0.999 8的高水平范围内。

方法检出限的测定：由于仪器对不同物质的最低响应不一样，通过向1 L实验室空白水样中加入10 μg/L喹诺酮类抗生素标准溶液20和50 μL，使水样质量浓度为0.2和0.5 ng/L，分别重复测定7次。再根据公式(1)计算方法检出限，测定下限为4倍检出限。

$ \mathrm{MDL}=t_{(n-1, 0.99)} \times S $

(1)

式中：MDL——方法检出限；t_(n-1，0.99)——自由度为n-1，置信度为99%时的t分布，当n=7时，t_(n-1，0.99)=3.143；S——n次平行测定的标准偏差。

由表 6可见，16种喹诺酮类抗生素的方法检出限为0.03~0.18 ng/L，测定下限为0.14~0.72 ng/L。16种喹诺酮类抗生素的检出限均低于以往研究水平^[19]，比起地方标准《水质喹诺酮类抗生素的测定液相色谱-串联质谱法》(DB 50/T 1366—2023)的检出限(2 ng/L)更是显著降低，特别是ORB、SPA、OXA的检出限均＜0.05 ng/L。

2.3 准确度与精密度

采集水产养殖池休渔期的排放尾水，选择合适的加标量，根据1.2节的预处理步骤，分别用水样配制0.2，2和20 ng/L的喹诺酮类抗生素标准溶液，每个质量浓度重复测定7次，以评估在低、中、高3种不同质量浓度水平下，实际水样中喹诺酮类抗生素的准确度与精密度，结果见表 7。由表 7可见，当加标量为0.2 ng/L时，16种喹诺酮类抗生素的回收率为64.9%~86.4%，相对标准偏差(RSD)为5.4%~14.6%；加标量为2.00 ng/L时，回收率为85.5%~107.7%，RSD为6.0%~13.0%；加标量为20 ng/L时，回收率为77.1%~94.0%，RSD为9.5%~14.5%。因此，该方法具有较好的准确度与精密度，不仅确保了定性、定量分析的可靠性，同时也展现了良好的稳定性，水样在预处理、固相萃取和仪器分析等全过程中所优化适配的条件参数能够达到对16种喹诺酮类抗生素进行全面有效检测的要求。

2.4 养殖尾水样品分析

2023年10月—2024年3月，每月采集3家典型的养殖区水产养殖尾水，按照本研究确定的方法，对水样中16种喹诺酮类抗生素进行定量分析。其中，10—11月为养殖期，12月清塘，1—3月为休渔期。通过监测发现，养殖期因为药物投放，各水样中16种喹诺酮类抗生素大部分均有检出，质量浓度为0~432 ng/L，其中均有检出且质量浓度较高的物质依次是NOR(50.1 ~ 432 ng/L)、ENO(18.2 ~ 113 ng/L)和CIP(4.64 ~39.3 ng/L)。绝大部分水样中有检出的物质是SAR和DAN，质量浓度分别为0~ 74.7和0 ~58.9 ng/L；均未检出的物质是LOM、ORB和SPA。清塘期间各水样中喹诺酮类抗生素绝大部分均有检出，质量浓度为0~448 ng/L。休渔期间，各水样中喹诺酮类抗生素质量浓度大幅度降低，为0~29.3 ng/L。3月份，3家养殖尾水水样中的FLX质量浓度分别为0.39，0和1.73 ng/L，NOR质量浓度分别为0.46，0.06和0 ng/L，CIP质量浓度分别为1.18，2.71和0.43 ng/L，DIF质量浓度分别为0.37，0和0.63 ng/L。如果参照《DB 50/T 1366—2023》的检出限，以上物质均未检出，但是按照本研究的检出限(0.03~0.18 ng/L)，质量浓度＜1 ng/L的CIP和其余15个质量浓度＜2 ng/L的物质，均可定量分析。

3 结语

本研究选取了16种喹诺酮类抗生素作为研究对象，运用了固相萃取-超高效液相色谱-三重四极杆质谱，建立了一套适用于养殖尾水中喹诺酮类抗生素精准定量的检测方法。对固相萃取条件、液相色谱流动相组成与比例、梯度洗脱程序等各项参数进行调整与优化。对水产养殖尾水水样进行检测，结果发现其中含有不同质量浓度的喹诺酮类抗生素。以休渔期水产养殖排放尾水为基质进行加标回收实验，结果表明，加标回收率为64.9%~107.7%，RSD为5.4%~14.6%。该方法的准确度和精密度均较好，能够满足养殖尾水中多种喹诺酮类抗生素同时定量分析的要求。